摘要：全身性感染是由感染所致的临床综合征，是一种高发病率和高病死率疾病，目前仍然是一项严重的临床问题。尽管在全身性感染治疗方面，人们已经取得了长足的进步，但是迄今为止，仍然没有有效的病因学治疗方法应用在全身性感染患者身上。这很可能是由于全身性感染的免疫病理学发病机制没有得到完全阐明所致。近来，TLR在全身性感染免疫机制中所起到的作用在多种动物体内得到验证，TLR2、TLR4在其中的作用尤为关键。TLR导致的体内信号传导，使炎症反应级联放大，此外，TLR还能诱发机体免疫功能紊乱，致使机体对病原体清除效率降低。这些原因都可以导致全身性感染的病情的进一步进展。所以阻断TLR传导通路可能会抑制全身性感染发生和发展的进程。这也为临床医生最终攻克全身性感染提供了崭新的思路和临床治疗靶点。

关键词：Toll样受体2；Toll样受体4；全身性感染；免疫耐受

The effect of Toll like receptor 2,4 in immune system, the new progress of study on which in correlation with sepsis. ZHANG Jie, WAN Xian-yao. The First Hospital Affiliated Dalian Medical University，Dalian 116021，China

Abstract：Sepsis is a clinical syndrome with a high morbidity and mortality, which is induced by infection. At present it is still a serious clinical problem. Although we have made a full-grown progress, so far there is not an effective therapic method focus on etiology of sepsis. It is probably due to the pathogenesis of immunopathology that has not been clarityed. Recently, it was discoveryed that TLR play a important role in the immunologic mechanism of sepsis, which has been validated in lots of animals. TLR2 and TLR4 is obviously significance in the TLR family. The signal transduction of TLR makes inflammatory reaction cascade amplification. In addition, TLR may make resistance mechanism disordering, diminish the efficiency of pathogen clearance. These make septic patient getting worse. Therefore, it could be an effective method that block the signal transduction of TLR to hamper the process of sepsis. It provides a new thread and therapic target to overcome sepsis for doctor.

Key words：sepsis，TLR2，TLR4，immunologic tolerance

全身性感染是由感染所致的临床综合征，表现为发热或低温、白细胞增多或减少、心动过速、呼吸急促等^[1]。由细菌感染所引起的严重感染和感染性休克，迄今仍然是世界范围内非心脏病ICU患者首要的死亡原因^[2]。据统计，在美国每年有逾75万例新发的严重感染患者，病死率高达28%~50%左右，且每年的发病人数正在以1.5%的比例增长^[3]。在我国虽然没有相关的流行病学资料，但估计应与美国的流行趋势相似，全身性感染已经成为危害我国广大人民群众健康的重要危险因素之一。

1 全身性感染的相关概念及新的临床诊断标准

1992年，美国胸科医师学会（ACCP）与美国危重病医学会（SCCM）将全身性感染定义为感染加全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。全身性感染表现为不能控制的炎症反应，是感染引起的全身炎症反应症候群；严重感染定义为全身性感染加急性器官功能障碍，感染性休克定义为全身性感染加液体复苏难以纠正的低血压^[4]。10多年来这些概念一直为大众所公认，但随着研究的进一步加深，一些欧美学者认为有必要对1992年版的SIRS和全身性感染的定义加以修改和重新审定。于是2001年12月ACCP、SCCM、美国胸科学会、美国外科感染学会和欧洲危重病医学会在华盛顿召开联席会议最后对全身性感染定义达成共识，将全身性感染定义为已确定感染或高度怀疑，且具有下述情况：①发热：体温>38.3℃或<36℃。②心率>90次/min或>年龄组正常值＋2SD（标准差）。③呼吸急促。④意识改变。⑤明显水肿或液体正平衡。⑥高血糖症。⑦炎症参数：WBC>12×10⁹/L或<4×10⁹/L；WBC计数正常而伴有杆状核细胞>10%；血浆C反应蛋白>正常值＋2SD；血浆前降钙素>正常值＋2SD。⑧血流动力学参数：低血压。⑨器官功能不全：动脉血氧含量过低、急性少尿、肌酐增高、凝血异常、肠梗阻（无肠鸣音）、血小板减少、高胆红素血症。⑩组织灌注参数：高乳酸血症；毛细血管充盈减慢或皮肤出现斑白纹^[5]。一般认为，全身性感染是由于机体过度炎症反应或炎症失控所致，并不是细菌或毒素直接作用的结果。全身性感染可以不依赖细菌和毒素的持续存在而发生和发展，细菌和毒素仅起到触发的作用。其发展与否及轻重程度则完全取决于机体的反应性。全身性感染、感染性休克和多器官功能障碍综合征（Multi organ dysfunction syndrome，MODS）是相互有联系的进行性加重的病理过程。

2 TLR与机体的免疫系统的关系

机体的免疫系统分为天然免疫系统和获得性免疫系统。获得性免疫系统又称特异性免疫系统，只存在于脊椎动物体内，是天然免疫反应的高级进化形式。该系统包括经典的抗体、淋巴细胞和免疫器官。其主要特点为对外来抗原具有特异性识别、免疫记忆和清除的生物学功能。

天然免疫系统又被称固有免疫系统，是哺乳动物进化最保守的免疫系统，是抵御病原体入侵的首道防线。但是，有关天然免疫的研究却相对滞后。新近研究显示，天然免疫反应在全身性感染的病理生理过程中起着重要作用。天然免疫系统进化相当保守，在所有的动植物体内均广泛存在，而且其反应方式和过程有某些相似之处，当病原体入侵时，天然免疫系统首先感知，并动员相应的细胞和介质以防止其进一步入侵直至将其清除，同时导致局部炎症反应，激活特异性免疫反应。

天然免疫系统可有效清除各种病原体侵入，如革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌、病毒及原虫等。病原体具有一些共同的抗原，可被天然免疫系统识别，这些抗原主要来自于病原体的细胞壁成分、鞭毛、核糖核酸等，它们有一个统一的名称即病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）。相对于外界数量庞大的PAMP，机体发展出一套特殊的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR），其中TLR就是一种很典型的PRR。TLR家族迄今为止已经发现至少13个成员，其中在哺乳动物体内发现10种，广泛分布于巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞等多种免疫细胞的表面^[6-10]，哺乳动物的TLR家族是具有胞外富亮氨酸区域以及胞浆内Toll-白细胞介素-1受体（Toll/interleukin-1 receptor，TIR）区域特点的Ⅰ型跨膜受体。TIR区域在其他的白细胞介素受体（Interleukin-1 receptor，IL-1R）家族中同样存在，介导同种或异种TLR与包含TIR区域受体之间的作用。Toll受体最早是在果蝇中被发现的，家族中所有成员都具有序列相似的果蝇Toll蛋白，它具有识别外部抗原的功能，如TLR2、TLR4可迅速识别革兰阴性菌释放的LPS，在其他辅助蛋白的协同作用下，充分活化并进一步激活炎症细胞内许多信号传导通路，继之引起杀菌/通透性增加蛋白、防御素等蛋白的大量急性释放^[11]。

3 TLR的信号传导途径

存在于革兰阴性细菌细胞膜上的LPS是一种比较常见的内毒素，也是研究宿主与病原体之间的反应以及诱导细胞活化的一种重要的工具。人们发现TLR4作为一种膜受体触发了LPS信号传导，从此揭开了应用LPS诱导细胞活化的崭新一页。Poltorak等^[12]发现在对LPS先天免疫的小鼠体内，TLR4基因在C3H/HeJ出现位点变异，在C57B110/ScCR位点出现缺失。TLR4的表达水平与机体对LPS应答程度及易感性有关^[13]。MD-2是一种在高尔基复合体中产生的分泌蛋白，并且和TLR共同表达于细胞表面，它在TLR4上游起信号引导作用，可以与细胞膜上TLR4准确的结合起来。此外MD-2对LPS应答起十分重要的作用，MD-2/LPS复合体比起单纯的LPS更容易与TLR4结合。这个复合体与TLR4在胞浆外结合，胞浆内借由TIR衔接蛋白与TLR4的TIR域部分通过嗜同种受体反应连接起来后，信号的传导由此开始^[14]。

现在已经发现5种TIR衔接蛋白在调节TLR信号传导中起作用。他们的共同特点就是在TIR区域中拥有相似的氨基酸序列。在TLR信号传导中参与最多的是髓系分化蛋白88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88），它最早被认识是在单核细胞系中作为诱导IL-6调节骨髓细胞分化的的骨髓分化初级应答基因^[15]。在所有的TLR和Ⅰ型IL-1R超家族的信号传导过程中MyD88被认为是一种极普通的衔接蛋白。TLR和IL-1R通过它们的TIR结合域与MyD88相互作用，激活核因子κB（NF-κB）。MyD88的羧基末端TIR域与拥有同源结构域的TLR胞浆内尾端相互作用，它的氨基端死亡结构域通过与IL-1R相关激酶（IL-1R associated kinase，IRAK）的相应反应域作用来调节信号传导^[16-18]。

IRAK家族包括IRAK-1、IRAK-4。他们在TIR家族的信号传导中起到重要的调节作用，他们可以上调或者下调信号的传导。首先，IRAK-1发生自身磷酸化作用，与受体复合物解离并与肿瘤坏死因子受体激活因子-6（tumor necrosis factor receptors associated factor-6，TRAF-6）相互作用^[19]。IRAK-1的酶活性在传导信号下调中是非必须因素，而当IRAK-4能够磷酸化IRAK-1时，则需要IRAK-1酶活性存在。此外，在IRAK-1缺陷的小鼠体内，对LPS的反应减弱，但并没有完全消失，但是IRAK-4缺陷的小鼠则对LPS丧失任何反应能力，这更显示了IRAK-4在TLR信号传导过程中的重要作用^[17,20]。

人们发现存在MyD88缺陷的小鼠丧失对TLR配体的反应能力，这对于人们认识MyD88在TLR信号传导中的作用非常重要^[21]。MyD88缺陷性小鼠抵御LPS引起的休克的能力明显强于正常小鼠。更有趣的是，当LPS刺激MyD88缺陷的巨噬细胞时，细胞不能产生炎性细胞因子，但另一方面，TLR4介导的NF-κB活化虽然较正常细胞来得慢，但是依然存在。这说明MyD88对炎症反应产生起重要作用^[22]。

最近的研究发现，TLR功能的实现，除了MyD88之外还依靠其他4种TIR衔接蛋白，包括一种与MyD88相关的叫Mal（MyD88 adaptor-like protein）的衔接蛋白也参与了信号传导。还有TRIF（Toll-interleukin-1 receptor domain-containing adaptor inducing interferon-β）、TRAM（Trif-related adaptor molecule）和SARM（Sterile α and HEAT-Armadillo motifs）等也参与其中。TRIF和TRAM一样，可以活化干扰素调节因子3（interferon regulatory factor-3，IRF-3）、IRF-7和MyD88依赖性信号传导通路。TLR4也活化上述这些通路，从而诱导IFN-α/β来调节整个活化过程。通过显性失活和小干扰RNA（Small Interfering RNA，siRNA）研究证明TRAM和TRIF、Mal、TLR4相互作用有影响下游区非MyD88依赖性TLR4信号传导通路的功能^[23]。TRAM显性失活的细胞抑制了由LPS诱导的信号传导，减少了NF-κB的活化以及细胞因子的合成^[24]。也有证据表明，TIR衔接蛋白在不同种类的细胞中发挥不同的作用。在成纤维细胞和内皮细胞中，MyD88和Mal在由LPS诱导的核抑制因子κB（Nuclear inhibiting factor-κB，IκB）磷酸化，NF-κB活化和IL-6、IL-8合成方面起到不可或缺的作用。与此相反，在单核-巨噬细胞中在由LPS诱导的IκB磷酸化，NF-κB活化和IL-6、IL-8合成方面根本不需要MyD88和Mal的参与，尽管Mal仍然参与了IFN-β的合成，这很可能与不同细胞表面TLR表达水平有关^[25]。SARM在依赖TRIF的TLR传导径路上起负性调节作用^[26]。

4 TLR与全身性感染

在细菌感染过程中，细菌致病成分诱导单核-巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等过度产生炎症介质，如肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IFN-γ、IL和一氧化氮（NO）等，它们被认为是引发全身性感染的重要因素。TLR所具有的识别病原体与启动免疫反应的能力在宿主对抗病原体的过程中起到十分重要的作用，长久以来，TLR2被认为是最重要的革兰阳性菌特异受体，而TLR4则被认为是革兰阴性菌特异受体。但是这种思维定势被新近的研究打破。在体外实验中，虽然TLR2、TLR4都参与了伯克霍尔德杆菌引起的细胞反应。但只有TLR2识别了伯克霍尔德杆菌的LPS，从而引起了完整的宿主免疫反应^[27]。

在由革兰阴性菌所致的感染中，TLR2、TLR4的相互作用可能导致了全身性感染的发生。Spiller等^[28]发现了一种被命名为1A6的能拮抗TLR4-MD-2复合物的单克隆抗体。如果在沙门菌或大肠埃希菌感染小鼠之前应用1A6再应用抗菌药物治疗，1A6可以阻止致命性休克的发生，然而在感染后再应用1A6却是无效的。相反，在革兰阴性菌感染4小时后联合应用1A6和拮抗TLR2的单克隆抗体，再联合应用抗菌药物治疗则对机体提供了强大的保护作用。与在鼠类研究中得出的结论一样，在革兰阴性菌感染或抗菌药物治疗的同时阻断TLR2、TLR4信号传导通路抑制了人类外周血单核细胞TNF-α的释放。鼠类脾细胞和人类外周血单核细胞释放IFN-γ都通过依赖TLR4的方式，导致细胞表面TLR2表达和TLR2配体的敏感性增加。这些都显示出TLR2作为一个重要的革兰阴性菌感染受体在全身性感染的起病机制方面起着重要的作用。

体外研究证明从全血和肺泡单核-巨噬细胞中分离出的被剔除TLR2、TLR4的细胞对伯克霍尔德杆菌是相对低反应性的。与此相反，转染TLR2或TLR4的HEK293细胞对伯克霍尔德杆菌是有反应的。令人大感意外的是，剔除TLR4的小鼠与野生型的小鼠在伯克霍尔德杆菌感染后的细菌繁殖和生存率方面没有显著性差异，而剔除TLR2的小鼠却表现出宿主防御反应增强，细菌数量减少和生存率明显提高等方面的明显优势，这说明TLR2可能还损害了由革兰阴性菌所致的全身性感染患者的宿主防御反应^[27]。

此外，创伤后的严重损伤与细菌细胞壁成分刺激产生的不同种类的促炎细胞因子表达变化有关，很容易产生一系列严重的包括全身性感染在内的并发症。50%的非洲裔美国人、42%的美国白人发生了创伤后全身性感染。相关的实验表明，全身性感染的发生与TLR2的基因表型是有一定相关性的，A/G vs A/A（62.5% vs 37.5%，P<0.03），但是关于黄种人相关性的研究，还少有报道，还需要大规模的基因表型研究来评价它的潜在诊断价值^[29]。

以往的研究认为脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）可作为配体与TLR结合，并通过TLR介导的信号途径传导信息。但最近Hattar等^[30]的研究发现LTA直接激发了细胞因子的释放，起初表现在TNF-α和IL-1β，然后为IL-8的释放，IL-8合成的第一阶段直接由LTA诱导，而第二阶段则由TNF-α内源性调节，此时IL-8的释放可以通过抗TNF-α抗体的中和，而被大幅度削弱。相反，IL-1β没有参与由LTA诱导的IL-8的合成。研究LTA诱导的细胞活化机制，TLR2、TLR4活性中和抗体试验显示细胞表面的蛋白质受体CD14参与了LTA介导的中性粒细胞细胞因子的生成。用抗体中和TLR2、TLR4的活性，仍然发现CD14依赖的、LTA诱导的中性粒细胞活化不通过TLR2、TLR4传导通路。由此可见，LTA所产生的效果不依赖TLR2、TLR4传导通路而产生作用。

5 内毒素耐受机制

机体反复接触LPS，可以导致对LPS的反应性进行性下降，这种现象叫做LPS耐受。耐受的产生与接触LPS的剂量和间隔时间都存在一定的关系。当单核-巨噬细胞接受不同剂量（包括0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml）LPS预刺激4h，隔夜接受同等剂量LPS再刺激（间隔21h），其中1μg/ml组TNF的释放增加，而100μg/ml组TNF的释放被抑制。再与立即予以同等剂量LPS再刺激组比较，可以发现立即予以LPS再刺激的100μg/ml组对TNF的释放有更加明显的抑制效应，而LPS 1μg/ml组接受或者不接受LPS预刺激没有差别^[31]。尽管LPS耐受在全身性感染和以TLR信号传导作为主要LPS测量机制方面有着重要的临床价值，但诱导LPS耐受的决定性机制仍然不清楚。在产生LPS耐受的过程中，TLR4传导通路上的受体、衔接蛋白和转录因子在数量、结构和功能上的改变在减少致炎细胞因子、升高抗炎因子和活化特殊的信号传导通路方面有重要作用。另外，TLR2也参与其中。由于全身性感染的发病机制与内源性炎症介质的过度释放和激活有密切的关系，因此探索LPS耐受的机制，寻找人体内源性的保护机制可能会帮助人类找到新的方法去战胜包括全身性感染在内的致命性的感染性疾病。

在此方面，Biswas等^[32]的研究发现，脂质A诱导的同源耐受具有下调依赖MyD88的促炎因子TNF-α和CC类趋化因子3（CC chemokine3，CCL3）、同时上调依赖TRIF的细胞因子IFN-β表达的特征。由于TRIF和IFN调节因子3的缺陷使LPS耐受诱导的TNF-α和CCL3表达抑制被很大程度的削弱，这显示了TRIF传导通路在LPS耐受中的作用。同时，选择性地激活TRIF诱导了对脂质A的耐受。此外，对IFN-β的预刺激同样诱导了耐受，然而加用IFN-β中和抗体可以部分减轻对脂质A的耐受，而不是由TLR2直接诱导了同源或者异源LPS耐受。

最近Härter等^[33]从全身性感染的患者体内新鲜分离出来的中性粒细胞和单核细胞TLR2和TLR4的表达均明显高于健康对照组，全身性感染患者中性粒细胞和单核细胞经过TLR配体催化16h后细胞中TLR2、TLR4表达显著上升，然而健康对照组的TLR表达却没有任何变化。尽管全身性感染患者细胞的TLR表达上升，但由LPS诱发的TNF-α和IL-8释放却没有相应提高，这说明全身性感染患者产生LPS耐受不单单依赖TLR2、TLR4的表达，可能还有别的因素参与其中，但这需要更进一步的研究证实。

6 全身性感染诱发的免疫抑制

全身性感染所导致的一种相对免疫抑制状态使病危患者易于受到二重感染从而增加病死率。Tsujimoto等^[34]的研究显示，无论是全身性感染患者还是外科术后患者，TLR2和TLR4在单核细胞中的表达都显著升高。体外实验中，LPS刺激可显著升高外科术后患者外周血单核细胞中TNF-α、IL-1β的生成。相较外科术后患者而言，全身性感染患者再次接受LPS刺激所产生的IL-1β减少。体外实验中，LPS刺激引起的TLR4的上调在外科患者和健康对照组中均有体现，但在全身性感染患者中却没有相关体现。全身性感染患者的外周血单核细胞有弱化机体对其他炎症信号反应的能力。但是这个缺陷和TLR4和CD14表达的减少没有直接关系。

Deng 等^[35]从全身性感染小鼠体内分离出来的单核细胞表现出对病原体的低敏感性及炎症反应机制受损的失活状态。利用由腹膜炎引起的小鼠全身性感染模型，使其经受铜绿假单胞菌感染的二次打击。感染性休克组与正常对照组比较，TLR2和TLR4表达并没有任何变化，而与此同时IRAK-M水平却明显上调。在接下来的二次感染打击下，IRAK-M缺陷的动物肺内和血液内细菌的清除率明显升高从而提高了生存率。因此，IRAK-M可能介导了由全身性感染产生的免疫抑制。

炎症细胞因子和抗炎细胞因子的平衡对于控制免疫平衡显得十分重要，而全身性感染的发生与免疫平衡机制失衡有着很大的关系，如何使机体的免疫抑制处于一种既不过于“夸张”又不过于“低调”的状态，对于全身性感染患者的预后起着决定性的作用。

7 展望

TLR拮抗剂的产生可能会减轻炎症反应的有害作用。至少可以从三个方面来研究减少TLR信号传导，从而减少特异生物学效应。第一，发展特异性可溶性的TLR家族成员，以结合并中和微生物或哺乳动物细胞配体。如在革兰阴性菌全身性感染中，可溶性TLR4或可溶性TLR2用于治疗由葡萄球菌外毒素引起的中毒性休克综合征，但目前的相关报道还比较少见。第二，发展小分子物质或抗体来干扰TLR的细胞外位点。这能在自然配体与效应细胞位于细胞表面的TLR位点结合之前防止其相互作用。例如，Daudeuf等^[36]通过实验证明TLR4/MD-2的单克隆抗体在感染性休克治疗方面已经取得一定的效果。第三，发展干预TLR细胞内位点的小分子物质。这个途径在配体与TLR结合后，防止细胞内信号分子与病原体的相互作用。Tsung等^[37]在体外实验中发现了一种被他们命名为P13的小分子肽对TLR信号传导有潜在的抑制性，可以限制由LPS介导的炎症反应并提高炎症小鼠模型的生存率。

天然免疫应答是机体防御感染性疾病的第一防线，临床医师不仅要了解炎症反应的发生机制，而且要知道如何调节与全身性感染、感染性休克有关的免疫异常。利用基因手段研究宿主与病原体之间早期的相互作用，TLR的发现为人体免疫与病原体之间关系提出了新的研究方向^[38,39]。目前研究主要采用离体模型，相信对TLR作用机制的深入研究可得知人类TLR基因的突变是否会增加对感染的敏感性，而且会为临床治疗LPS引起的感染性休克、MODS提供新途径，从而改善全身性感染患者的预后。

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