摘要：胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF )是神经营养因子家族成员之一，GDNF对中枢和周围神经系统多种神经元的生长、发育、分化、维持和损伤修复起重要作用。另外，GDNF还参与中枢和外周水平神经病理性疼痛的形成和发展。该文主要就GDNF和神经病理性疼痛的研究作一简要综述。

关键词：胶质源性神经营养因子；神经病理性疼痛

Glial cell line-derived neurotrophic factor and Neuropathic pain

   神经病理性疼痛是一种常见并且严重影响人类健康的疾病，甚至可导致患者最终失去行动能力，全世界受此病困扰者达数百万，故成为神经科学关注的重点。目前已经明确：神经病理性疼痛是由于手术等造成的神经损伤或糖尿病、带状疱疹、艾滋病以及部分肿瘤等疾病产生的外周或中枢神经功能异常所致。有关神经痛产生的外周和中枢机制一直是近年来痛觉研究的热点之一。GDNF是从大鼠胶质细胞系B49的无血清培养液中分离纯化得到的一种新型神经营养因子。早期研究表明，GDNF对培养的多巴胺能神经元有特异的促活、促分化作用^[1]，随后发现GDNF对发育和成熟的运动神经元亦有很强的营养作用，尤其对运动神经元的营养作用尤为突出。研究发现其与神经病理性疼痛关系密切，对损伤所继发的细胞变性有促进恢复效应^[2，3]。动物实验显示，GDNF对多种原因造成的神经损伤

具有明显的保护作用^[4]，从而为神经系统疾病的治疗开辟了新的途径。认识GDNF的生物特性及其对神经病理性疼痛的作用，有助于了解GDNF的生理功能，有利于探讨神经病理性疼痛的预防和治疗途径。本文就近年来有关GDNF及其对神经病理性疼痛作用的研究做一简要综述。

1  GDNF基本基因和蛋白结构                                                                      

目前已成功克隆人及鼠的GDNF基因，并在原核及真核载体中获得表达。人类GDNF基因位于第5号染色体短臂，包含3个外显子和2个内含子^[5]。GDNF基因由超过12 000个碱基对组成，编码134个氨基酸，由二硫键连接形成同源二聚体的糖基化蛋白。成熟的GDNF蛋白中含有7个半胱氨酸残基，其中41和102、68和131、72和133位半胱氨酸残基之间形成3对链内二硫键，101位的半胱氨酸残基形成链间二硫键，从而构成GDNF的同源二聚体结构^[6]。GDNF的结构特点属于转化生长因子β超家族的成员，在全身各种组织中均有表达，而且在组织发育的不同阶段以及神经组织损伤后再生过程中的不同阶段也有不同程度的表达。GDNF在进化上具有相当的保守性，人与鼠GDNF的成熟蛋白质氨基酸序列同源性高达93%，利用基因工程获得的人GDNF对鼠多巴胺能神经元亦有活性，表现出GDNF的种间交叉活性。

2  GDNF在神经系统中的表达

早期研究发现，新生小鼠富含多巴胺能神经元的部位有GDNF mRNA表达，如纹状体和中脑黑质，后来又发现脑皮质、中脑以及海马组织等部位也有表达，在外周非神经组织中亦有GDNFmRNA表达，在发育个体中的皮肤、肾、胃和精囊呈高表达，而在成熟个体的小肠呈现高表达^[7]。GDNF广泛分布于中枢神经系统的多巴胺能区域，在腹侧苍白球、嗅结节以及梨状区等接受多巴胺能神经元支配的区域也有表达；在非多巴胺能神经元支配的区域如胚胎小脑原基、丘脑、海马、基底前脑、脊髓背角等的原代培养物中都可检测到GDNF mRNA的表达^[8]。Golden等采用原位杂交的方法检测成年小鼠中枢神经系统中GDNF及其受体的表达情况，结果发现GDNF及其受体的mRNA主要表达在神经元，GDNFmRNA表达量较低，在前脑皮层、嗅结节、纹状体、中脑黑质、海马、小脑颗粒细胞层及蒲肯野细胞层、丘脑、下丘脑中有GDNFmRNA表达。GDNF mRNA在成年大鼠中主要表达于神经元，分布在皮层、海马、纹状体、丘脑、中脑黑质、小脑及脊髓^[9]。GDNF在机体中各组织器官的广泛表达提示GDNF对其它器官组织也可能存在作用。

3  GDNF的作用机制

GDNF效应的发挥依赖于与其受体的结合，即GDNF受体的存在是各种神经元对GDNF产生应答的前提。GDNF虽然属于转化生长因子-β超家族成员，但其受体却不是跨膜丝氨酸或苏氨酸激酶，而是由固定于细胞膜外层的GDNFRα和Ret蛋白组成，Ret蛋白则是各GDNFRα受体的共同的配基。GDNF能与GDNF受体A亚基结合，使得受体酪氨酸激酶RET磷酸化后转导细胞内信号。GDNF的异源二聚体受体是由糖基-磷脂酰肌醇锚定蛋白GFRα1和原癌基因c-ret的基因表达产物Ret构成，其中GFRα是受体复合体的高亲和力部位，决定受体的特异性。目前研究表明，GDNF可能的作用机制为：GDNF首先与其有高度亲和力的GDNFRα结合，引起GDNFRα二聚化，但GDNFRα固定于细胞膜的外层，没有跨膜部分，故其不能发出传导信号。二者结合后可发挥协同作用，促进GDNFRα与Ret蛋白的结合，进而激活Ret蛋白的磷酸化，而Ret蛋白磷酸化后则可以激活下一步细胞内的信息传导通路，从而发挥GDNF的生物学效应。

4  GDNF对神经的保护作用

4.1  GDNF对脊髓神经的保护作用

最初的研究认为，GDNF是一种较强的多巴胺能神经营养因子，能特异性促进大鼠胚胎中脑培养物中多巴胺能神经元的存活与分化。研究表明，GDNF对胆碱能神经元和运动神经元也有较强的作用。研究发现将GDNF-BHK工程细胞与中脑腹侧颅神经运动核神经细胞和脊髓运动神经元共同培养8日后，中脑运动核的胆碱乙酰转移酶活性增加5~6倍，脊髓运动神经元胆碱乙酰转移酶活性增加1~2倍^[10]。研究发现GDNF对离体脊髓神经元、脊髓前角神经元和外周神经均有保护作用^[11]。GDNF重组腺病毒对培养的原代脊髓运动神经元具有保护作用，发现在一定的时间和合适的腺病毒滴度条件下，腺病毒介导的GDNF能够缓解体外培养的脊髓运动神经细胞的凋亡^[12]。外源性GDNF 能保护成年大鼠坐骨神经切断术后相应节段脊髓前角运动神经退行性变，并且这种保护作用在损伤的早期较晚期更为显著。在大鼠脊髓机械性损伤模型中，研究发现损伤周围的星形胶质细胞中GDNFmRNA表达增加，且位于损伤脊髓白质处的星形胶质细胞中，GFRa-1 RNA表达亦增加。脊髓机械性损伤后GDNF及其受体mRNA的表达，提示GDNF对脊髓损伤有保护作用。脊髓损伤后产生刺激信号，通过轴突反馈到靶器官，刺激骨骼肌产生大量GDNF，并经轴突逆行运输到脊髓神经元胞体，发挥营养作用，表达水平与对神经元的营养作用程度及对脊髓损伤反映程度呈正相关^[13]。

4.2  GDNF对多巴胺能神经元的作用

研究发现向成年鼠纹状体内注入外源性的GDNF后，多巴胺能神经纤维向注射部位生长，同侧纹状体内多巴胺能神经元数量增多，多巴胺的代谢也与之存在剂量相关关系^[1]。在帕金森病(PD) 动物模型观察到无论是向恒河猴脑黑质或纹状体内注射GDNF，还是脑室内持续注射GDNF都能显著改善动物行动迟缓、四肢僵硬、平衡功能异常的帕金森样症状^[14]。这不仅依赖GDNF对黑质神经细胞体的保护和恢复作用，更关键在于可使失去黑质多巴胺能神经纤维支配的纹状体恢复再支配。但GDNF对成人脑部多巴胺能神经元的再生和突起生长的作用尚未肯定。研究表明，不仅大鼠纹状体内注射重组腺病毒携带的GDNF 基因能有效预防6-OHDA对黑质多巴胺能神经元的损伤^[15]，小鼠纹状体内注射也能预防神经毒素MPTP对多巴胺能神经元的损伤^[16]。GDNF 能对抗6-OHDA的细胞毒性，使损伤的多巴胺能神经元的死亡率显著下降^[17]。实验证明GDNF基因治疗能有效地保护细胞免受MPTP的损伤，更重要的是，GDNF能逆转MPTP的损伤效应。因此，GDNF能特异性促进多巴胺能神经元的存活，在治疗帕金森病中具有潜在的应用价值^[18]。

4.3  GDNF对运动神经元的作用

GDNF 促进运动神经元存活的作用比BDNF、睫状神经营养因子及白血病抑制因子分别强75、650、2500倍。研究显示大鼠脊髓损伤后外源性局部给予GDNF和NGF可减少损伤区域运动神经元死亡的数目。前者还能在损伤后早期促使脊髓前角神经元的存活和功能的恢复，其对脊髓保护作用的机制可能与减少神经细胞内钙离子聚集、缓解组织肿胀、减轻脊髓组织缺血有关^[19]。Yan等局部应用GDNF可减少面神经切断后的新生鼠运动神经元死亡和萎缩，减轻面神经核因损伤而造成的ChAT免疫反应性下降。新生鼠坐骨神经切断可致同侧运动柱40%运动神经元死亡且残存运动神经元萎缩，而应用GDNF可阻止此种死亡及萎缩，并可导致存活的病损运动神经元良好发育^[20]。坐骨神经损伤后，GDNFmRNA在损伤部的远侧段迅速上调并伴其受体GFRa-1mRNA上调，表明其对神经有营养支持作用。另一方面，坐骨神经挤压伤时局部应用外源性GDNF可使轴突再生明显加速。而撕脱伤后，局部应用GDNF可防止50%的运动神经元死亡，并使残存的运动神经元体积增大。而其他神经营养因子，如NGF、BDNF、IGF-l等却无此作用。由于在实验研究中发现GDNF对运动神经元有明显的营养作用，可以阻止运动神经元死亡，加速神经元恢复，临床上已开始尝试将GDNF用于治疗某些运动神经元疾病，如肌萎缩性侧索硬化(ALS)等疾病。

5  GDNF与神经病理性疼痛

外周神经损伤后，通常导致机体感觉异常，并出现慢性痛即神经病理性疼痛。此时，神经系统的明显反应之一是损伤外周神经内GDNF的表达上调及外周神经和后角GFRα-1受体表达的增加^[21]。但这些GDNF及其受体的上调不可能完全阻止神经损伤的病理过程。GDNF及其受体表达的变化，在关节炎模型的慢性疼痛大鼠，后角GDNFmRNA表达迅速发生持续性下调，GDNF 本身的水平在DRG和脊髓也出现下调^[22]。

离体神经元培养证明，GDNF可以明显增加DRG神经元中P物质和辣椒素受体VR1 的表达，这两种物质和伤害性感受密切相关。神经损伤后A类纤维中P物质的异常表达可能在神经痛的产生中起作用，并且受到NGF的调节，这样在不表达NGF受体的DRG神经元中，GDNF的作用就显得尤为突出，并且极有可能在神经病理性疼痛中起重要作用^[23]。在损伤的局部应用外源性GDNF 也能减少神经元死亡，促进功能恢复。GDNF不但可以阻断损伤轴突的中型感觉神经元细胞的病理损害过程，提高背根节细胞的神经传导速度^[24]，而且还能恢复机体对伤害性热觉及压觉的敏感性。此外，GDNF还可能通过调节感觉神经元的基因（如功能上与痛觉行为有关的基因）的表达而发挥镇痛作用。

Ramer等研究发现，外源性GDNF可以阻止和逆转大鼠的感觉异常，而不影响其正常的疼痛反应行为。使用多种神经营养因子治疗大鼠脊神经后根损伤的实验中，GDNF可有效促进后根神经元中枢突再生进入脊髓，相应的行为学研究结果也表明，在使用GDNF后，大鼠对热和压力刺激的敏感性得以恢复^[2]。Buncher 等^[3]将大鼠的一侧坐骨神经或腰部脊神经结扎后，再使用GDNF和其他神经营养因子，结果显示GDNF可防止神经痛的出现，并发现手术前后给予GDNF，均可逆转手术所致的感觉异常，并且GDNF能够阻止术后疼痛引起的相关变化，认为其作用机制之一是GDNF阻止了神经病理性疼痛时河豚毒素敏感型钠通道的过度表达。

已有多项实验研究显示，蛛网膜下腔给予GDNF或是通过基因工程技术使GDNF高表达均可显著抑制大鼠神经痛^[3，25]。这些实验结果清晰的说明GDNF在神经病理性疼痛发生中发挥着重要作用。许多证据也表明，GDNF可能通过多种途径对神经痛发挥抑制作用。GDNF可以抑制促使神经痛发生的A类传入纤维出芽和神经肽Y的表达增加，阻断粗的有髓传入纤维的异位电活动。另外，GDNF还可以促进某些内源性镇痛物质如生长抑素的释放。而局部应用GDNF可保护神经细胞免于自由基损伤，并能完全阻止缺血后NO 的产生以及再灌注造成的损伤，表明GDNF 是有效对抗缺血性损害的保护因子，对于局部组织缺血所致的疼痛具有潜在的治疗作用。因此，GDNF可能作为一种新的治疗神经痛的有效方法。

GDNF对损伤后的神经元有很强的保护作用，这些作用与其本身及有关的受体复合物在机体的分布有关。神经损伤后，局部GDNF及受体复合物表达上调。这些GDNF以顺行性等方式运输或因胶质细胞激活分泌而上调的GDNF，能够选择性保护感觉神经元及其纤维、抑制A纤维异常长芽和钠通道亚单位表达的异常增加以及调控感觉神经元痛觉行为基因的表达，从而减轻神经病理性疼痛的病理改变。成年运动神经元损伤后，机体通过自身调节机制使受伤局部内源性的GDNF增加，促进神经修复，这种表达在损伤后30min开始增加，3h达到高峰，这可能在脊髓损伤后急性炎症反应中对神经元有保护作用，可以减轻脊髓损伤导致的中枢性疼痛^[26]。

6  问题及展望

迄今为止，对GDNF的研究目前还仅限于实验室研究阶段而未能在临床上推广应用，主要是因作为一种大分子蛋白质，GDNF难以透过血脑屏障，神经系统单次或多次给药不仅疗效短暂，而且危险性大、费用昂贵，自发活动增加和体重减轻等副作用也十分明显，患者难以接受^[1，27]。如何将GDNF 基因通过适当的载体靶向性地导入病变脑区，使之稳定地表达GDNF 蛋白并作用于受损的神经元而不影响其他神经元是GDNF 应用于临床治疗所面临的主要问题。目前治疗的途径可能有两种，即应用外源性GDNF及促进内源性GDNF释放。在大鼠的实验表明，GDNF脑脊液内灌注可起到治疗效果但有体重下降的副作用。其中蛛网膜下腔内注入与脑室内注入相比有促运动神经元存活效果好、体重下降反应轻的特点。另外一种可行的给药方法是将GDNF溶入纤维蛋白胶并敷于患处，GDNF与纤维蛋白胶可良好结合并缓慢释放。

目前研究最多的是利用病毒转载人rhGDNF基因，并植入患病部位使其大量表达。如通过立体定向技术将携带rhGDNF基因的腺病毒注入帕金森病动物模型的黑质或纹状体，使其长期缓慢表达rhGDNF，可观察到显著的治疗效果^[28]。同样，将该转基因病毒应用于受损脊髓或运动神经元也可观察到明显的神经元修复及再生。用这种方法转移GDNF基因应该同样适用。值得注意的是，重组腺病毒载体在体内引起的免疫排斥反应和细胞毒性作用正越来越受到重视。随着分子生物学尤其是基因工程研究的不断深入，通过各种方法定向激活GDNF 等基因，使其在特定部位大量表达内源性GDNF及其他相关神经营养因子则有可能使有关神经系统疾病的治疗进入一个新的阶段。

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