摘要

 目的 检测脓毒症患者外周血中CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg的比例（Treg%）变化,并探讨它和患者细胞免疫紊乱之间的关系。方法 收集ICU病房的脓毒症患者为病例组（n=27），健康查体者为对照组(n=40)。将脓毒症患者根据28天预后分为死亡组（n=8）和存活组（n=19）。监测APACHEⅡ评分、Treg％、CD3%、CD₄/CD₈， Ag-NORs数量（IS%）等。以上指标各组进行比较，统计分析。结果  和对照组相比，病例组Treg％明显升高，CD3%、CD₄/CD₈、IS%明显下降，均有显著统计学意义(P<0.001)。行相关分析发现脓毒症患者的Treg％和CD₄/CD₈，IS%呈负相关，分别有r=- -0.484（P<0.01）及r=－0.588（P<0.01）。同样发现，死亡组和存活组相比，前者Treg％明显升高(P<0.001)，CD3%、CD₄/CD₈、IS%明显下降（分别有P<0.001、 P<0.05、 P<0.001)。结论  脓毒症患者早期就有CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg的明显升高，并发生细胞免疫紊乱，因CD3%、CD₄/CD₈、IS%明显下降，升高的CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg通过一定途径参与细胞免疫功能紊乱的发生。

关键词：  脓毒症 ；调节细胞；细胞免疫

责任作者及联系方式： 张丽娜； E-mail:zln_109@126.com

The relationship between the level of CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg and cell immunity in patients with sepsis  ZHANG Li-na ,WU Tie-jun，LIU zhi-jun. Intensive Care Unit,Liaocheng People’s Hospital. Liaocheng,Shandong,252000,China

Abstract

 Objective  To investigate the percentage of CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg in peripheral blood of patients with sepsis and explore its effect on cell immunity. Metheds  select patients with sepsis in ICU as case group（n=27）, healthy volunteers were enrolled as control group(n=40)。Devied the sepsis patients into death group and survival group depend on the outcome after 28 days .Detect APACHEⅡscore、Treg％、CD3%、CD₄/CD₈、IS% etc.Compared between assosiated groups . Progressed statistical analysis. Results  Compared with the control group , the percentage of CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg was significant higher and the CD3%、CD₄/CD₈、IS% were significant lower in case group ,all had significant statistics significance(P <0.001). Correlation analysis indicated that Treg％had negative correlation with CD₄/CD₈、IS%(P<0.01).Samely, Compared with the survival group , the percentage of CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg was significant higher(P<0.001) and the CD3%、CD₄/CD₈、IS% were significant lower（P<0.001、 P<0.05、 P<0.001) in death grou p .Conlusion  The percent of CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg was significent higher and CD3%、CD₄/CD₈、IS% were lower which indected cell immunity disorder even in the earlier period of sepsis . The CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg produced a marked effect on the development of cell immunity disorder.

Key words： Sepsis ；Regulatory cells；cell immunity

Corresponding author: ZHANG Li-na, E-mail:zln_109@126.com

脓毒症是临床危重病患者主要死亡原因之一，在美国每年约有54万脓毒症患者，其中21.5万患者终因脓毒症而死亡^【1】。近年来，人们对脓毒症的发病机制及发病过程有了更深的了解，大量研究表明脓毒症患者可发生严重的免疫功能紊乱，尤其是免疫功能低下，这也是导致脓毒症患者死亡的重要原因，但是其具体机制尚不明了。因此深入探讨脓毒症患者免疫紊乱发生的参与因素具有重大的临床意义。CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg细胞是近年来新发现的一种负向免疫调节细胞，它可以通过许多途径影响机体的免疫状态。本文通过研究脓毒症患者外周血中CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg及细胞免疫学指标CD3％、CD₄/CD₈、IS%的变化特点，来探讨CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg对脓毒症患者细胞免疫的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象：

选择2007年8月～2008年8月入住我院ICU的脓毒症患者27例，均符合2001年12月在美国华盛顿召开的国际脓毒症定义会议所制定的脓毒症诊断标准^【2】。其中肠破裂、肠坏死术后14例，感染休克5例，胆囊坏死切除术后4例，会阴感染1例，宫腔感染3例。所有患者均无自身免疫性疾病病史，无恶性肿瘤，近期未应用过免疫性药物。健康对照组40例，均选自本院健康查体者，年龄、性别构成较对照组均无明显差异。

1.2 监测指标：

于诊断成立后的24小时内无菌抗凝抽取静脉血2ml，2小时内应用流式细胞仪技术（FCM）进行外周血Treg％、CD3％、 CD₄/CD₈的检测。同时取无菌抗凝血0.3-0.5ml加入T淋巴细胞培养液中，37℃培养72小时，分离细胞并低渗破膜后搜集细胞核制片，硝酸银染色，应用图像分析系统，每例患者随机取10个淋巴细胞核，计算核仁银染面积与核面积的比值（IS%），取其平均值作为检测结果。

1.3 统计学方法：

全部数据采用SAS6.12 统计软件进行统计分析，所有数据采用均数±标准差（ ±S）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脓毒症患者Treg%明显升高，而细胞免疫学指标CD3％、IS%和CD₄/CD₈  则明显降低，和对照组相比均有统计学意义，p<0.01。如表1所示。

2.2就Treg%、IS%、CD₄/CD₈的关系行Speman相关分析，得出：Treg%和CD₄/CD₈(r=- -0.48433,p=0.01)及IS%(r=－0.588,p=0.001)均呈负相关。

3.3 根据28天预后将脓毒症患者分为死亡组和存活组，死亡组Treg%和  APACHEⅡ评分明显高于对照组，分别有p<0.01和p<0.05.而IS%、CD₄/CD₈  、CD3%均低于存活组，均有p<0.01。如表-2所示。

3 讨论

脓毒症是创伤、烧伤、休克、感染等临床急危重患者的严重并发症之一，由于脓毒症来势凶猛，病情进展迅速、病死率高，给临床救治工作带来很大的困难。脓毒症的本质是机体对细菌感染出现的过度反应，病原体及其毒素造成的炎症损害及机体的免疫功能状态均起着至关重要的作用。CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg是1995年Sakaguchi等在小鼠体内发现的^[3]它占正常人和小鼠外周血CD4T细胞的1%～2%，特征性地表达CD25 (IL-2受体的α链)，具有广泛的免疫抑制效应，关于CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg与脓毒症关系的相关报道日渐增多，深入了解CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg在脓毒症免疫中的作用及其调节机制，将有助于预见炎症的发展方向，为实施有效的干预提供新思路。

Ag-Nor是脱氧核糖核酸核蛋白体（rDNA）周围的一种有活性的非组蛋白，具有指导rDNA合成和组装rDNA的功能，可以通过银染的方法显示。细胞化学证明，银染核仁组成区的相对定量值IS%是反映细胞内转录活性及蛋白合成水平的重要标志，是反映细胞增殖能力的较好指标^[4]。T细胞主要是由CD₄辅助性T细胞（Th）、CD₈抑制性T细胞（Ts）、杀伤性T细胞（Tc）组成，共同参与免疫应答过程，CD₄/CD₈比值表示Th和Ts之间的功能平衡状态，比值下降，说明细胞免疫功能受到抑制，提示病情严重和预后不良。CD3则代表外周血成熟T细胞的总数。本研究观测脓毒症患者外周血中 Treg％及细胞免疫学指标 IS%、 CD₄/CD₈ 、CD3％的变化，进而探讨CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg在脓毒症患者细胞免疫中发挥的作用。

研究结果发现，脓毒症患者第一天就有CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg显著升高，并且出现细胞免疫功能低下，因其CD3％、CD₄/CD₈   IS%均较对照组明显降低。进一步统计学分析发现， Treg%与IS% 、CD₄/CD₈呈负相关。说明，脓毒症患者体内负向免疫调控细胞CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg在发病早期就有明显升高，并且这种升高的调节细胞可能通过一定的途径影响到患者的细胞免疫状态，参与脓毒症患者的细胞免疫紊乱。并且这种现象在死亡患者中表现的更为明显，因为死亡者CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg的升高及CD3％、CD₄/CD₈   IS%的降低均较存活组为甚。说明CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg在一定程度上可以反映脓毒症患者的病情严重程度，预测患者预后。

Wisnoski 发现脓毒症小鼠和伪手术组小鼠相比，无论是脾脏还是外周血中，前者的CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg 的比例及活性（活性标志物FOXP3的表达率，混合细胞培养试验中CD4⁺CD25⁺ Treg抑制CD4⁺CD25⁻ T细胞增生的能力）均高于后者^[5]。Monneret等^[6]对脓毒性休克患者与健康人CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg在CD4⁺T细胞中所占比例进行比较时发现，脓毒性休克开始即存在CD₄⁺CD₂₅⁺/ CD₂₅^－T细胞绝对数下降，但随之CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg很快恢复至正常对照范围，而CD₄⁺ CD₂₅^－细胞则出现显著下降。对Foxp3 mRNA的检测结果未显示脓毒性休克后其表达增加，而是与CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg的变化规律一致，因此他们认为，CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg比例的增高并不是该细胞增殖的结果，而是由于对CD₄⁺ CD₂₅^－T细胞选择性清除造成的。这可能源于细胞受凋亡机制影响程度不同，但这一设想有待于进一步证实^[7]。

升高的CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg可通过多种途径影响机体的免疫功能。在T淋巴细胞激活过程中，白细胞介素2（IL-2）以自分泌、旁分泌和内分泌形式作用于T淋巴细胞，被认为是T淋巴细胞增殖的必要条件。IL-2是细胞增殖信号，CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg细胞上的CD₂₅为IL-2受体α链，且CD₂₅分子在Treg细胞上呈高表达状态，能够与效应细胞竞争结合IL-2，使效应细胞无法得到生长信号而不能增殖^[8]。而本试验表明细胞增殖指标IS%显著降低，即T细胞增殖能力下降，可能与此有很大关系。

无论是脓毒症动物模型或者是死于脓毒症和多脏衰的患者均有淋巴细胞的大量凋亡，尤其是CD4细胞和 B 细胞。CD₄⁺CD₂₅⁺Treg可以导致抗炎细胞因子TGF-β和IL- 10的升高，抑制淋巴细胞的增殖，并诱导高表达FAS和FASL的活化的T淋巴细胞发生FAS－FASL结合，两者结和后，通过caspase级联反应，导致T淋巴细胞彼此杀伤或直接“自杀” ^[9]，使T细胞总数和活化的T细胞数量下降，可以使机体免于遭受过强的免疫反应而造成的损伤，同时也导致了机体免疫能力低下，对内毒素等抗原的处理能力减弱，其中CD4凋亡更为明显，这可能是CD3、CD₄/CD₈下降的原因。

此外，CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg经TCR介导的信号刺激活化后，能抑制CD₄⁺和CD₈⁺T细胞活化和增殖。CD₄⁺T细胞活化后分泌两类相互拮抗的细胞因子，其中分泌致炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（TNFα）、γ干扰素（IFNγ）、IL2的CD4^＋Ｔ细胞为Th1；分泌抗炎细胞因子如IL4、IL10的CD4＋T细胞为Th2。Th1介导保护性免疫反应，活化巨噬细胞，杀灭病原体；Th2介导非保护性免疫反应。有资料证实， LPS刺激后CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg细胞升高且抑制功能增强，导致倾向于Th2型的免疫反应。意味着移除CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg细胞必将增强效应性CD4+T 细胞向Th1的极化，从而强化这些效应细胞引起的免疫应答。可见CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg的增减决定着Th1/Th2作用主次关系的转换，同时决定着炎症反应的发展方向。而Th1向Th2的漂移。 这也是是  脓毒症患者发生免疫紊乱的主要机制之一^[10]。

Heuer等^〔[11]〕采取盲肠结扎穿孔术（CLP）制备鼠脓毒症模型，观察到与CD4⁺T细胞相比，过继转移CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg后细菌的清除率显著增高，生存曲线显示小鼠存活率显著提高。CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg犹如一把双刃剑，在一定程度上可以起到抗炎作用，但过量的Treg则会降低机体的免疫功能，增加死亡风险性。

目前，关于CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg在脓毒症中的研究尤其是临床观察还很有限，其对脓毒症发生与发展的意义如何，对疾病转归起着怎样的作用，通过何种途径实现对炎症反应的调节，及其确切的调控机制等诸多问题都有待于更深入的探讨。由于脓毒症的研究牵涉到大量细胞因子及炎性介质，且与神经、内分泌因素等形成复杂的网络调节效应，故任何单纯致力于某几种或某几类细胞或细胞因子的研究，都不可能揭示其根本发病机制，这正是动物实验与临床应用不相符甚至矛盾的症结所在。随着CD₄⁺CD₂₅⁺ Treg对机体免疫状态及调节机制认识的日益深化，许多作用环节都可能成为临床干预的切入点，从而为防治脓毒症及其他感染性疾病提供新策略。

参考文献

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