责任作者（通讯作者）：段满林，Email：duan9001@163.com

 【摘要】目的 观察神经病理性痛模型大鼠损伤侧损伤和邻近未损伤背根神经节神经元高电压激活钙电流的变化，以探讨两组神经元钙电流在大鼠神经病理性痛发病过程中的潜在作用。方法 采用SD雄性大鼠，以左侧L5脊神经结扎离断术建立神经病理性痛模型。酶消化法急性分离模型组损伤侧L5(SNL-L5组)、 L4(SNL-L4组)以及正常对照组L5、L4背根神经节神经元(C组)，采用全细胞膜片钳技术记录神经元高电压激活钙电流。结果 SNL-L5组与SNL-L4组峰值钙流密度均较C组降低（P<0.05）,且SNL-L5组的峰值钙电流密度亦低于SNL-L4组（P<0.05）。与C组和SNL-L4组相比，SNL-L5组钙电流半数激活电压向超级化方向移动（P<0.05），其N型钙电流比例上升 (P<0.05)。三组钙电流稳态失活曲线均无显著性差异（P>0.05）。结论  神经病理性痛模型大鼠损伤背根神经节神经元高电压激活钙电流密度降低，电流激活曲线向超级化方向移动，N型Ca²⁺电流比例升高，提示损伤背根神经节神经元高电压激活钙电流可能在诱发神经病理性痛的过程中起主导作用。

【关键词】钙通道；神经痛；神经节，脊；神经元

Changes of high-voltage-activated calcium current in dorsal root ganglion neurons isolated from neuropathic pain rats

SUN Xiao-di, ZHU Min-min, CHENG Xiao-dong  et al. Department of Anesthesiology , School of Medicine , Nanjing University/Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command , PLA , Nanjing 210002 , China

Corresponding author: DUAN Man-lin,Email:dml9001 @163.com

[Abstract]  Objective We investigate the changes of high-voltage-actived (HVA) current in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion (DRG) neurons in a rat model of spinal nerve ligation (SNL) and the underlying contribution. Methods Pathogen-free male SD rats（weight ,180～220mg）aged 4-6 weeks were used in this study. The animals were anesthetized with intraperitoneal pentobarbital sodium 50 mg/kg. L5 spinal nerve was ligated between DRG and sciatic nerve and cut distal to the ligature. The animals were decapitated on the 14th postoperative day. L5 and L4 DRGs were respectively isolated and the neurons in the ganglion were enzymatically dissociated. The control group of rats were not accepted the surgery. The lumbar DRG neurons of this group were gained with the same method.The HVA-Ca²⁺ current was recorded using whole cell patch clamp technique. Results Peak calcium current density was significantly diminished in the SNL-L5 and SNL-L4groups compared with that in the control group（P<0.05）. Compared with the SNL-L4group, the SNL-L5 group also markedly reduced peak current density (P<0.05). Half-activation value (V_a1/2) was also significantly lower in the SNL-L5 group versus in the control and SNL-L4 groups（P<0.05）. The N-type relative contribution to the total HVA-Ca²⁺ current markedly elevated in the SNL-L5 group compared with that in the control and SNL-L4 groups（P<0.05）. There was no significant difference in steady-state inactivation curves among the three groups(P>0.05).  Conclusion In neuropathic pain rats , the HVA-Ca²⁺ cuurent of the injured DRG neurons may play a key role in inducing neuropathic pain.

[Key words] Calcium channels；Neuralgia； Ganglia,spinal；Neurons

神经病理性痛是临床上常见的顽固性疼痛的综合症，其发病机制复杂，目前尚未完全阐明。在发病过程中，背根神经节(dorsal root ganglion , DRG)神经元所表达的高电压激活（high-voltage-actived，HVA) Ca²⁺通道对神经元敏化的形成和维持起关键作用^[1]。目前认为，脊神经结扎离断( spinal nerve tight ligation , SNL)模型中至少有两组神经元产生异位放电：损伤及邻近未损伤传入神经元。二者均被假设能诱发和维持神经病理性痛，然而关于两组神经元在发病过程中的作用及地位问题一直存有争议^[2]。本研究运用全细胞膜片钳技术，以正常大鼠腰段DRG神经元为对照，观察SNL大鼠损伤及邻近未损伤DRG神经元HVA-Ca²⁺电流的变化，对比研究两组神经元HVA-Ca²⁺电流是否或如何参与神经病理性痛的发生。

材料与方法

1.模型制备与鉴定:健康清洁级SD雄性大鼠，年龄4～6周，体重180～220g,由南京军区南京总医院实验动物中心提供。根据Kim的方法建立大鼠左侧L5脊神经结扎离断模型^[3]：腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg深麻醉后，在腰椎上方做皮肤切口，暴露并咬断左侧L6脊椎横突，用5-0医用丝线在靠脊柱侧结扎L5脊神经，并在远端剪断，然后逐层缝合肌肉和皮肤。于术后3，7和14天，进行后肢机械刺激回缩反应测定。机械刺激产生快速回缩为正常反应，而出现持续2s以上的抬足、甩足或舔足敏化反应特征行为时为阳性反应。每天重复测试5次，间隔3分钟，选取在3天测试中，伤害足平均阳性反应率超过20%而对侧足反应正常的SNL大鼠用于实验。

2.神经元急性分离: 参照Gold的方法进行DRG细胞的急性分离^[4]：术后14天时，腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg深麻醉后，将SNL大鼠断头处死，迅速提取腰段脊柱，放入预先充好氧气的冰冻DMEM培养液（DMEM 13.4g/L，NaHCO₃ 3.7g/L，pH值7.2）中，分离出损伤侧L4和L5DRG，将其放入装有I型胶原蛋白酶（2mg/1ml）和I型胰蛋白酶（1.2 mg/1ml）的玻璃试管中，将玻璃试管放入恒温（定温至36.5 ℃）水浴箱中，并通入含5%CO₂/95%O₂的混合气体。孵育25min后，用细胞外液（mmol/L：TEA-Cl 145、MgCl₂ 0.8、CaCl₂ 5、HEPES 20、D-glucose 10，Trisbase调pH值至7.3）清洗5-6遍以终止酶的消化。用吹打管吹打神经节，将制成的细胞悬液滴入35mm培养皿中，细胞自然贴壁2～3h后开始膜片钳实验。每次实验均在细胞分离后8h内完成，所有实验均在室温（22～25℃）下进行。

3.实验分组：选取胞膜清晰、折光性好，表面光洁的中等大小（30～40 μm）的神经节细胞进行实验，共分为三组：正常对照组（C组），SNL大鼠L5DRG组（SNL-L5组）和SNL大鼠L4DRG组(SNL-L4组)。SNL-L5组为结扎离断的L5脊神经的DRG细胞，SNL-L4组为邻近L5脊神经的L4脊神经DRG细胞。C组大鼠不进行手术，用同样方法获取其腰段DRG细胞作为对照。

4. Ca²⁺电流记录: 采用EPC-9膜片钳放大器(HEKA公司，德国)进行全细胞Ca²⁺电流记录，电刺激脉冲方案和电流的记录由pulse + pulsefit程序控制完成。记录用微电极尖端直径为1～2 μm，充灌电极内液（mmol/L：CsCl 135，MgCl₂ 2，EGTA 11，CaCl₂ 1, HEPES 20，Mg-ATP 5，Li-GTP 0.4，Trisbase调pH至7.3）入液后电极阻抗为2-6MΩ。细胞破膜以及电流记录过程中的慢电容、串联电阻、系统电阻、电容电流和漏电流均自动补偿。实验过程中，选取串联电阻＜20 MΩ且电流稳定的数据为有效数据。形成全细胞模式以后，在步阶电压的刺激下，得到一内向电流，此前我们的研究已证实，此内向电流即为HVA-Ca²⁺电流^[5]。破膜后稳定10 min，给予不同的刺激方案记录Ca²⁺电流。

5.观察指标: (1)激活曲线：膜钳制电位为-90 mV，施加一组-70 mV～+40 mV，以10 mV递增，时程为80ms的指令电压记录激活电流，激活曲线由Boltzmann方程 G/Gmax=1/{1+exp[(Va1/2-Vm)/ Ka]}进行拟合，G为电导，G=I/(Vm–Vr) ，I为电流，Vm为指令电压，Vr为反转电位，Va1/2为半数激活电压, Ka为激活斜率因子；(2)电流-电压（I-V）曲线：采用激活刺激方案记录不同去极化电压的Ca²⁺电流，以电流密度（电流值和细胞容积的比值）为指标作I-V曲线；(3)失活曲线：膜钳制电位为-90 mV，给予-90 mV刺激10 ms，随后施加一组-70 mV～+20 mV，以10 mV递增，时程为500 ms的指令电压，然后给予-10 mV，时程为80ms的命令电压记录失活电流。稳态失活曲线由Boltzmann方程 I/Imax =1/{1+exp[(V-Vi1/2)/Ki]}进行拟合，I为电流，V为预刺激电压，Vi1/2为半数失活电压，Ki为失活斜率因子；(4)神经元各亚型HVA-Ca²⁺电流比例变化：膜钳制电位-90mv，对DRG神经元先施以-10 mv（或0mv）,时程80 ms的刺激电压引出峰值Ca²⁺ 电流，待电流稳定后，分别加入20μmol/L硝苯地平（L型Ca²⁺通道阻断剂，美国sigma公司，57h1139），2μmol/L ω-Conotoxin MVIIC（P/Q型Ca²⁺通道阻断剂，美国sigma公司，017k4765）或2μmol/L ω-Conotoxin MVIIA（N型Ca²⁺通道阻断剂，美国sigma公司，028k4801），再给予-10 mv（或0mv）,时程80 ms的刺激电压记录电流。电流抑制率= (I加药前– I加药后) / I 加药前*100%。

6.统计学处理: 采用Clamfit8.1和SigmaPlot10.0软件进行数据采集与处理。计量数据以均数±标准差（ ±s）表示，Va1/2，Vi1/2，电流密度及电流比例各组间比较均采用单因素方差分析，进一步两两比较采用q检验。采用SPSS16.0软件进行数据统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结   果

1. 三组神经元HVA-Ca²⁺电流I-V曲线的比较：

与C组HVA-Ca²⁺峰电流密度值（143.6±23.7）pA/pF相比，SNL-L4组（103.5±16.6）pA/pF以及SNL-L5组（75.1±17.0）pA/pF均减低(P<0.05)， 差异有统计学意义。与SNL-L4组相比，SNL-L5组时的峰电流密度进一步减小（P<0.05）。同时，HVA-Ca²⁺峰值电流的激活电压C组及SNL-L4组时为0 mv，SNL-L5组向超级化方向移动至-10mv ,见图1。

2.  三组神经元HVA-Ca²⁺电流激活和稳态失活曲线的比较：

SNL-L5组神经元Ca²⁺ 电流激活曲线的半数激活电压V_a1/2为（-20.7±0.3）mV，较C组（-16.2±1.9）mV与SNL-L4组的(-16.0±0.4) mV分别向超级化方向移动了4.5mV和4.7mV,差异具有统计学意义(P<0.05)，而SNL-L4组与C组的V_a1/2无显著性差异(P>0.05，图2C)。三组Ca²⁺电流稳态失活曲线均无显著性差异（P>0.05，图2D）。

3. 三组神经元中各型HVA- Ca²⁺电流比例的比较：

加入20 μmol/L硝苯地平，2μmol/L ω-Conotoxin MVIIC或2μmol/L ω-Conotoxin MVIIA后，SNL-L5组DRG神经元峰值电流的抑制率分别为（15.4±2.3）%，（23.4±2.4）%和（50.0±2.7）%,此即代表SNL-L5组中L、P/Q和N型Ca²⁺电流占总HVA- Ca²⁺电流的比例（图3A）。C组及SNL-L4组L、P/Q、N型Ca²⁺电流比例分别为：（27.9±2.5）%、（23.5±1.6）%、（35.9±1.4）%和（26.1±1.8）%、（22.9±1.3）%和（37.1±2.0）%。与C组及SNL-L4组相比，SNL-L5组N型Ca²⁺电流比例均升高（P<0.05），L型Ca²⁺电流比例均下降（P<0.05），差异有统计学意义。三组P/Q Ca²⁺电流比例均无显著性差异(P>0.05)。在C和SNL-L4两组中，三型Ca²⁺电流比例的变化均无显著性差异(P>0.05)，见图3B。

                          讨   论

    神经损伤所引起的DRG神经元功能的紊乱是导致神经病理性痛发病的重要原因。有研究表明，SNL后损伤侧L4和L5 DRG神经元膜电生理特性明显不同^[6]。本研究所采用的SNL模型是模拟临床神经病理性痛的经典模型，SNL损伤大鼠表现为长时程的痛觉过敏和机械性痛觉超敏。该模型的优点是损伤变异程度小，动物个体间的差异仅来自于动物生物学变异，尽可能排除了实验误差。同时，可以将损伤与邻近未损伤DRG从解剖学上完全分开，有利于比较在神经病理性痛中，两组神经元HVA-Ca²⁺ 电流变化的异同。

本研究结果表明，神经病理性痛模型大鼠损伤和邻近未损伤DRG神经元HVA-Ca²⁺ 峰电流密度均较正常神经元降低，且与邻近未损伤神经元相比，损伤神经元峰电流密度进一步降低。Ca²⁺ 通过VDCCs内流的一个重要功能就是调节钙激活钾通道（calcium-dependent potassium channels，K_Ca)的功能。K_Ca是调节神经元活性的关键离子通道，该通道开放的减少可导致神经元兴奋性增高。Hogan等的研究已证明，SNL损伤引起的损伤DRG神经元Ca²⁺电流的降低可减少K_Ca电流，K_Ca电流的减少可引起膜后超级化幅度和持续时间的减少，最终导致神经元兴奋性增高和神经病理性痛的产生^[7]。因此，损伤和邻近未损伤DRG神经元Ca²⁺峰电流密度的降低提示在SNL损伤后，两组DRG神经元兴奋性均增高，这可能是诱发神经病理性痛的原因之一。本研究中，与正常和邻近未损伤神经元相比，损伤DRG神经元HVA-Ca²⁺ 峰电流的电压值向超级化方向移动了10mV，且其半数激活电压V_a1/2亦向超级化方向移动，表明SNL损伤引起损伤DRG神经元HVA-Ca²⁺激活阈值降低，更易激活。

脊神经损伤可引起脊髓背角和DRG神经元上VDCCs重要辅助亚基α₂δ表达增多，后者可促进神经病理性痛的发生^[8~10]。α₂δ可通过对核心亚基α₁的调节来影响Ca²⁺内流。此外，α₂δ亚基与其他亚基的共表达可加速VDCCs的激活，并使其电流-电压关系向超级化方向移动。因此，损伤DRG神经元激活曲线的改变可能与脊神经损伤后DRG神经元上α₂δ表达增多有关。Li等的研究也发现，与正常小鼠相比，高表达α₂δ的转基因小鼠DRG神经元VDCCs电流的激活曲线向超级化方向移动^[8]。损伤DRG神经元的激活曲线向超级化方向移动，稳态失活曲线未移动，提示窗口电流增大，Ca²⁺内向电流应增多，然而我们记录到的HVA-Ca²⁺ 电流却是降低的；同时，邻近未损伤神经元激活和失活曲线均无明显变化，表示其窗口电流未发生变化，但记录到的HVA-Ca²⁺ 电流亦是降低的，此表明HVA-Ca²⁺通道激活动力学和失活动力学的变化可能不是导致神经病理性痛大鼠DRG神经元HVA-Ca²⁺电流降低的原因。

   本研究结果显示，与正常和邻近未损伤神经元相比，损伤DRG神经元HVA-Ca²⁺电流比例变化表现为L型Ca²⁺电流比例下降，N型Ca²⁺电流比例升高，而正常与邻近未损伤DRG神经元的各亚型HVA-Ca²⁺电流比例则无显著性差异。目前认为，N型Ca²⁺通道与疼痛的关系最为密切，被公认为是镇痛的首选靶点。Yang等在小鼠部分坐骨神经结扎模型^[11]以及Matthews等在大鼠SNL模型^[12]中均发现DRG神经元N型Ca²⁺电流比例升高。这些结果均提示，N型Ca²⁺通道可能在神经病理性痛的发生及维持中占主导作用。有研究表明，在大鼠神经病理性痛模型中L型Ca²⁺通道mRNA表达降低，而N型Ca²⁺通道mRNA的表达无明显变化^[13]，因此我们推测，损伤神经元上亚型Ca²⁺电流比例的改变可能与SNL损伤后DRG上各型Ca²⁺通道密度的变化有关。

邻近未损伤传入神经元在神经病理性痛的发病过程中可能发挥了重要作用^[14,15]。本研究发现，与正常神经元相比，邻近未损伤DRG神经元仅Ca²⁺电流密度是降低的，提示其神经元兴奋性是增高的。邻近未损伤DRG神经元兴奋性的增高可能促进了SNL损伤后痛觉过敏和异常性疼痛的发生^[16]。此外，我们发现，在SNL损伤后，损伤与邻近未损伤DRG神经元HVA-Ca²⁺电流特性的变化并不一致，这可能是两组神经元在SNL损伤后遭受了不同病理损伤的结果。目前认为，SNL损伤后，损伤神经元的轴突残端可发生变质退化，释放大量细胞因子和炎性介质，这些炎性反应物作为刺激源可引起邻近未损伤神经元的激活和过度兴奋，从而导致邻近未损伤神经元离子通道分布和活性状态的改变，而损伤神经元电生理特性的改变可能主要是由SNL直接损伤所引起^[2]。

    在本实验条件下，神经病理性痛模型大鼠损伤DRG神经元HVA-Ca²⁺电流密度降低，电流激活曲线向超级化方向移动，其Ca²⁺电流中与疼痛密切相关的N型Ca²⁺电流比例升高，而邻近未损伤DRG神经元仅HVA-Ca²⁺电流密度降低。这些变化提示，损伤DRG神经元HVA-Ca²⁺电流可能在诱发神经病理性痛的过程中起主导作用。

参 考 文 献

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