材料和方法<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

　　动物模型及分组：61例雄性wistar大鼠体重250-300g，采用Pulsinelli 法^[1]制备大鼠全脑缺血模型。分离双侧翼孔并电凝烧闭椎动脉，然后分离双侧颈总动脉。2天后，夹闭颈总动脉10分钟，造成全脑缺血。缺血前后将温度探头插入颞肌部位，观察头部温度，白炽等照射大鼠头部，维持温度在37℃左右。缺血开始后动物出现瞳孔散大，四肢伸展，反正反射消失等现象，说明全脑缺血确切，否则剔除。缺血10分钟后松开颈总动脉，行缺血再灌注。动物分为9组，缺血再灌注24小时(I A组,n=7)，48小时(I B组,n=7)，72小时(I C组,n=7)，7天(I D组,n=7)；缺血+异丙酚24小时(II A组,n=7)，48小时(II B组,n=7)，72小时(II C组,n=7)，7天(II D组,n=7)；非缺血对照组(III组,n=5)。
　　麻醉方法：三组动物首次预处理时，均于腹腔内注射10%水合氯醛0.03ml/kg。异丙酚组于缺血后静脉持续注射异丙酚1.5ml/h，并持续30分钟。
　　标本取材及处理：于预定时间麻醉，断头取脑。取出新鲜海马组织，加入PBS液。研磨，过200目筛子，离心1000转5分钟，弃上清，加PBST700 μ1，记细胞数约为1.2×107/ml。
　　Annexin V染色：取100μl单细胞悬液，加Annexin V/FITC 5μ1，室温30分钟避光。PBS洗1000转5分钟，弃上清。加PBS液5μ1，浓度为20g/mlPI，室温避光10分钟，PBS洗1000转5分钟，留0.5ml上流式细胞仪检测。
　　表面抗原及细胞内抗原的染色：取五只试管，各加100μ1单细胞悬液，加入triton X-100，终浓度为1%，分别加入bcl-2，Bax, p53, caspase3 鼠单抗2μ1(1:50)(Santa Cruz公司产品)及空白对照。室温避光30分钟后，PBS洗1000转5分钟，弃上清，加入FITC标记的抗鼠IgG(1:100)，室温避光10分钟后，PBS洗1000转5分钟，弃上清，加含0.5%多聚甲醛的PBS液250μ1，上流式细胞仪检测。
　　统计学分析：流式细胞仪的激发波长为488nm，记数10,000个细胞，用FASCan软件进行数据分析，给出散点图和分布图，并分别记录细胞凋亡，坏死及活细胞数量和百分比。同时，记录bcl-2, Bax, caspase3, p53蛋白的表达数及百分率。结果处理采用spss软件包，组间用单因素方差分析，P＜0.05有显著性差异。

结　果

　　凋亡和坏死率结果：缺血再灌注7天凋亡率最高，坏死率峰值出现在24小时，缺血组凋亡率和坏死率明显高于异丙酚组（见表1）。
　　bcl-2和Bax蛋白表达的结果：bcl-2在假手术组表达极低，但Bax在假手术组即有高表达。Bax蛋白峰值出现在缺血再灌注之后72小时，而bcl-2蛋白峰值出现在缺血再灌注后48小时(表1)，缺血组Bax表达率明显高于异丙酚组(P<0.05)，但两组bcl-2表达无显著性差异(P>0.05)。
　　caspase3蛋白表达的结果：从流式细胞仪的检测结果来看，凋亡基因caspase3蛋白在假手术组表达极低，缺血再灌注后24小时就有表达，峰值出现在72小时(表1)。

　　p53蛋白表达的结果：p53在假手术组表达极低，p53蛋白峰值出现在缺血再灌注之后24小时(表1)，与非缺血对照组比较有显著性差异(P<0.05)。

讨论<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

　　流式细胞术在临床和实验研究中的应用非常广泛，它通过一个激光源和有关的光学仪器组成检测系统来收集信号，进行分析。可以快速，精确的检测通过检测区域液流中的细胞或大分子。对培养细胞，单细胞悬液等做定性，定量分析。在凋亡检测方面，细胞凋亡早期，细胞膜的变化之一是细胞膜内的磷脂酰丝氨酸(PS)转移到外层，并暴露在细胞膜的表面。Annexin V是一种磷脂酸结合蛋白，与PS有很高的亲和性，将其用荧光素FITC标记后，与PI共同孵育细胞。PI对坏死细胞嗜染，而对其它细胞拒染，用流式细胞仪便可以区分正常细胞，坏死细胞和凋亡细胞各个时期。近年来，运用荧光标记的抗细胞表面及细胞内抗原的抗体，结合破膜打孔，渗透和固定技术，应用流式细胞仪也可以检测细胞表面及细胞内抗原的表达^[2]。
　　bcl-2家族(bcl-2 family)与哺乳动物细胞凋亡调节有关^[3]。其家族成员有bcl-2,bcl-xl, Bax, Bak等，bcl-2, bcl-xl为抑制凋亡基因，Bax, Bak为促进凋亡基因，bcl-2和Bax表达比例决定细胞是否发生凋亡^[4]。
　　caspase3 为ICE家族的重要蛋白酶之一。ICE家族至少有11个成员，caspase1-11与哺乳动物ced-3同源^[5]。caspase过度表达能引起培养细胞发生凋亡^[6]。Caspase3对不同的细胞通过不同的途径诱发细胞凋亡。对于培养神经元来说，营养物质的耗竭，降低K⁺的浓度及增加兴奋性氨基酸都可以引起caspase-3增加而诱发凋亡^[7]。而且，ICE或者caspase3抑制剂对局部脑缺血有保护作用^[8]。所以，caspase3在神经元凋亡中起着重要的作用。
　　p53因其编码53KD蛋白质而得名，它是一种抑癌基因(antioncogene)。它可以通过细胞周期的G1关卡作用和治疗因子活性，延迟DNA受损的细胞进入S期，或诱导不能修复的受损DNA死亡，从而抑制肿瘤的发生发展^[9]。
　　异丙酚脑保护作用的机制是多方位的，如有报道认为它可以抑制钙离子内流，抑制兴奋性氨基酸的产生，抗氧化作用及降低脑代谢率等。本研究重点探讨的是目前认为这些调控基因中最重要的bcl-2家族，caspase3，p53等，选取了两个作用相反而又有代表性的指标，bcl-2为抗凋亡基因而Bax为促凋亡基因。本研究的结果显示，异丙酚组凋亡率和坏死率明显低于缺血组，说明异丙酚对于海马神经元凋亡有一定的抑制作用。同时，促凋亡基因Bax在缺血组的表达高于异丙酚组，但两组bcl-2的峰值均出现在缺血再灌注之后48小时，而且缺血组和异丙酚组无显著性差异。缺血组p53蛋白表达率明显高于对照组，p53蛋白表达峰值出现在再灌注24小时。异丙酚组p53的表达明显低于缺血组。Caspase3在异丙酚组的表达明显降低。因而认为，在异丙酚对大鼠海马神经元缺血再灌注的保护作用中，抑制凋亡基因bcl-2的作用甚微，可能与此药物减少凋亡促进基因Bax蛋白和p53蛋白及caspase3的表达有关。但细胞凋亡中有多种细胞和因子参与，是一个相互影响和制约的复杂网络。有关异丙酚对脑缺血神经元保护作用的机制仍需进一步研究。

参考文献
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7.Deshukh M, Vasilakos J, Deckwerth TL, et al. Genetic and metabolic status of NGF-deprived sympathetic neurons saved by inhibitor of ICE family proteases. J Cell Biol, 1996,135:1341-1354.
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