The Modifcation of Fluorimetric Assay for Plasma Concentration of Vecuronium<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

孙海燕 Haiyan Sun  薛富善 Fushan Xue
李  平Ping Li     杨  冬Dong Yang
李成文Chengwen Li
中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院麻醉科，北京 100041
Department of Anesthesiology, Plastic Surgery Hospital, Academy of Mecical Sciences and Peking Union Medical college, Beijing 100041

ABSRACT

Objective: To provide a simple and easy fluorimetric assay for plasma concentration of vecuronium.
Method: On the basis of fluorimetric assay described originally by Kersten, we improved the following measures during determination: ①rasing the pH of sodium bicarbonate buffering solution and increasing the its buffering capacity; ②centrifuging the sample at high velocity (10,000rpm) and constant temperature (10℃); ③increasing the concentration of fluoresent indicator.
Results: By the modified fluorimetric assay, there was a godd correlation between the plasma concentration of vecuronium and fluorescent intensity of the sample. The lower limit of sensitivity of this technique was 0.05μg/ml for vecuronium. The resolving power of the modified fluorimetric assay was 0.025μg/ml and the rate of reclamation was (89.8±13)%. The coefficients of variation at the concentrations of 0.05、0.4and 1.0μg/ml were 1.5%、6.2% and 3.7%, respectively in our laboratory.
Conclusion: The modified fluorimetric assay could determinate precisely the plasma concentration of vecuronium.
Key Words: Vecuronium; Plasma concentration; Fluorimetric assay

　　维库溴铵是目前在临床被广泛使用的新型中效非去极化肌肉松弛药，主要优点是恢复速率快和无心血管副作用^[1]。本研究的目的是提供一种简单易行的维库溴铵血药浓度测定方法，并探索维库溴铵在国人的药代动力学特点，旨在为临床麻醉中安全使用此新型中效非去极化肌肉松弛药提供资料。

材料和方法<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

　　试剂：试剂尽可能采用优级纯，配制试剂及全部操作用水均系玻璃三蒸。
　　本测定方法所需的主要试剂及其配制方法如下：①维库溴铵标准品为荷兰Organon公司生产，以0.01M配制工作液（0.001mg/ml），当日配制。②四氯四碘荧光素，使用前素需纯化。称取一定量的四氯四碘荧光素粉末放入细口烧瓶或容量瓶中，用醋酸乙酯冲洗6遍，然后再用氯仿冲洗3遍，避光阴干，在避光条件下保存备用。将纯化好的四氯四碘荧光素粉剂用0.45M磷酸氢二钾配制成1mg/ml储存溶液，在黑暗、4℃条件下可保存4d。四氯四碘荧光素工作液（0.5mg/ml），当日配制。③0.2M碳酸缓冲液：将0.2M碳酸氢钠缓冲液缓慢加入到0.2M碳酸氢钠溶液中，调至pH为10.5。④氯仿。⑤丙酮。
　　器材：本测定方法所需的主要测定仪器如下：①荧光分光光度仪（RF-540，日本岛津公司）；②调速往返式水平振荡器；③液体混合器；④高速冷冻离心机；⑤带帽塑料离心管，需要经15%硝酸浸泡15h；⑥15ml带塞玻璃试管及离心管，需经洗液、15%硝酸依次浸泡清洁各15h以上；⑦微量加样器。
　　血浆的制备：测定采用的血浆取自正常成人，将肝素抗凝全血用高速冷冻离心机以4000转/min离心10min，吸取上清血浆，保存在-20℃条件下备用。


　　生化测定步骤：①加样：选用40ml带塞塑料离心管，依次加入内含维库溴铵的标准液或血浆1ml、碳酸氢钠缓冲液1ml、荧光素工作液0.5ml、氯仿7ml。每加入1种试剂后均需要在液体混合器上充分混匀；②混匀：将塑料离心管放置在调速多用往返式振荡器上振荡30min，振荡速度以液体振荡幅度最大而又不外逸为准；③离心：将塑料离心管放置在高速冷冻离心机中，选择10，000转/min，10℃条件离心10min；④提取：离心完毕，吸弃上清水相，精确吸取有机相0.5ml，置于内含3.5ml丙酮的带塞玻璃管内充分混匀后待测示；⑤荧光测定：选择“比率”测定，激发/发射波长为546/570nm，狭缝10nm。


　　标准曲线的绘制及计算：以水做溶剂：选择药物浓度范围0.05～2.0μg/ml，以药物浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制维库溴铵水溶液浓度的标准曲线（图1）。然后以血浆为溶剂，以同样方法绘制药物血浆浓度曲线（图2）。并用最小二乘法计算荧光强度与药物浓度之间的回归方程。

结果<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

　　特异性：本方法所测维库溴铵荧光强度为药物母体和代谢产物强度的总和。故其激发光谱及发射光谱也是两者混合的体现；维库溴铵的发射光谱（见图3）。

　　敏感性：本方法能够测出的维库溴铵最低血浓度为0.05μg/ml。
　　线性关系：在0.05～2μg/ml的浓度范围内，维库溴铵的荧光强度与其浓度呈线性关系。在水溶液中，测定的荧光强度与药物浓度之间的回归方程为：Y（荧光强度）=2.567+7.43×水中药物浓度（μg/ml），r=0.998，P＜0.001。在血浆中荧光强度与药物浓度之间的回归方程为：Y（荧光强度）=0.322+3.05×血药浓度（μg/ml），r=0.996，P＜0.001。
　　稳定性：由于实际实验过程中血浆本往往需要放置24h后方能进行测定，为此我们对该方法的时间延迟进行了系列观察。取血浆标本分装在16只试管内，将其随机分成四组，放置时间与试验结果（见表1）。

　　分辨率：本方法测定维库溴铵血浓度的分辨能力为0.025μg/ml（P＜0.01）。
　　重复性：分别取低、中、高3种浓度的血浆标本各10份进行重复测定，结果（见表2）。

　　回收率：随机选择正常人5名，静脉注射维库溴铵，使体内的药物浓度达到1.2μg/ml，然后取样测定实际血中的维库溴铵浓度，得到的回收率为（89.8±13）%。
　　正常人药物浓度-时间曲线：我们用本方法对8例正常患者作了维库溴铵血浆药物浓度药代动力学测定，绘制出药物浓度-时间曲线（图4），其特点为典型的多房室模型药代动力学。

讨　论<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

我们建立的维库溴铵血药浓度荧光测定法，综合改良了文献报道的方法；使其实验操作步骤简化、结果稳定、回收率亦满意。本法测出的维库溴铵最低血浓度为0.05μg/ml，类似于文献中报道的结果^[2-3]。
　　本测定方法汲取了既往文献报道方法的可取之处：①选用四氯四碘荧光素作为荧光显示剂。②用氯仿作为有机提取剂。③充分振荡30min，以求提取完全。
　　我们的主要改进措施是：①提高碳酸氢钠缓冲液的pH值（7.8→10.5）；增大缓冲容量（0.1M→0.2M），以保证药物能够在一个稳定的碱性环境中与荧光显示剂充分络合。②实验中发现，有机提取液中酚的去皂化作用小于其降低荧光强度的作用，故去掉酚成分，单纯选用氯仿作为提取剂。③恒温高速离心（10℃，10000转/min），以减少药物的分解，提高分离效果。④增加荧光显示剂的浓度，使其能够与药物充分结合，提高测定的荧光强度。⑤据文献报道，用丙酮作为最后提取液的稳定性不可靠，并可导致被测物的荧光强度降低。故Wingard等^[4]在1979年报道的方法中即取消了丙酮，直接测定氯仿提取液，但我们在试验中发现，直接测定提取液，结果极不稳定，而用其他溶剂代替（乙醇）结果亦欠佳。故我们仍在提取液中加入一定比例的丙酮，而且结果稳定，虽然荧光强度有所降低，但属系统误差，可消除。
　　本方法主要具有以下特点：①具有文献报道方法的主要优点，如线性及敏感性好、分辨率高、回收亦满意。②优于文献报道的方法，如操作步骤简化、方法稳定、重复性好、适于临床和科研应用^[5-6]。

参考文献
1. Lien CA. Rational use of muscule relaxants. IARS 1994 Review Course Lectures. Presented at the 68th Clinical and Scientific Contress of the International Anesthesia Research Society, Orlando, Florida, March 5-9,1994,P66-72
2. Kersten UW, Meijer DKF, Agoston S. Fluorimetric and chromatographic determination of pancuronium bromide and its metabolites in biological materials. Clinica Chimica Acta, 1973,44:59-66
3. Rupp SM, Castagnoli KP, Fisher DM, et al. Pancuronium and vecuronium pharmacokinetics and pharmacodynamics in younge and elderly adults. Anesthesiology, 1987,67:45
4. Wingard LB, et al. Modified fluorimetric quantitation of pancuronium bromide and metabolities in human material and unbilical serums. Pharmacent Sci, 1979,68:914
5. Waston MJ. A modified method for the fluorimetric determination of pancuronium bromide in plasma. Clin Chimica Acta. 1977,79:511
6. Ellis N. Fluorescent analysis of d-tubocurarine hydrochloride. J Lab Clin Med, 1963,2:338

　　孙海燕，女，28岁，中国协和医院大学博士研究生，曾在国内专业杂志发表论文2篇，参加编写专著四部，共计15章35余万字。曾为《现代呼吸道管理学-麻醉与危重症治疗关键技术》和《困难气管插管技术》两部专著副主编。