Changes of Circulating Soluble Fas　Ligand(sFasL)　Concentrations During General Anesthesia<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

鲁惠顺  胡肪  俞正伟  卫木根  汪子伟  彭亮
杭州市第一人民医院杭州,310006
Hui-shun Lu，Fang Hu，Zheng-wei Yu，Mu-gen Wei，Zi-wei Wang，Liang Peng
Department of Anesthesiology，Hangzhou First People′s Hospitai，Hangzhou 310006，China

ABSTRACT

Objectiv：The aim of this study was to measure the serum soluble Fas ligand (sFasL )in patients with general anesthesia and to study the changes of the substance in different anesthetics.
　　Methods：42 patients(male24,female18)were selected and divided into A,B and C groups randomly .Blood sample were saved separately before anesthesia induction and after operation.Three groups were induced with different ansthetics to observe the effect on circulating soluble fas ligand (sFasL)concentrations.All blood samples were tested by enzyme-linked immunosorbent assay(ELlSA).
　　Results：It had been found that serum sFasL concentration levels were elevated significantly (p＜0.05＝after operation but non significant changes compared among the three groups.
　　Conclusion：The results indicated that different anesthetics could be the same effect on cifculating sFasL concentration .The changes of sFasL concentra-tiong after operation could be concerned with mechanical ventilation else.
　　Key words：General anesthesia anesthetics；Soluble Fas ligand； Enzyme-linked immunosorbent assay
　　Corresponding author：Hui-shun Lu；E-mail：luhs88@sina.com

Fas-FasL系统在体内具有重要的生理功能，并且与多种免疫性疾病、血液系统疾病以及肿瘤的发生有关，在维持生物体内的自身稳定中起着重要的负调控作用。细胞膜上与膜蛋白结合的FasL可以被金属蛋白酶裂解为可溶性FasL(sFasL)分子，并在血液循环中维持动态平衡。SFasL也具有生理活性作用，在Fas与FasL结合的过程式中发挥调节作用，从而在免疫耐受中起重要的作用，目前认为多种麻醉药物对机体免疫功能具有不同程度的影响，本研究拟通过手术病人在麻醉药物应用后循环sFasL的变化，了解机体Fas/FasL系统的稳定状态,从而阐述麻醉药物地机体免疫功能影响的可能机制。

材料和方法<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

一般资料
　　以非肿瘤上腹部手术病人作为观察对象,心电图、胸片、肝功能、凝血功能等辅助检查无异常为纳入标准双盲随机将42例病人分入三组（A、B、C组），经气管插管，静脉和吸入麻醉下手术。42例受试者中男性24例，女性18例。平均年龄52.06±19.87(岁)，平均体重57.78±11.43(kg)。
　　麻醉方法
　　开放静脉通路后，A组芬太尼0.004mg•kg^-1、维库溴胺0.04 mg•kg^-1、咪唑安定0.1 mg•kg^-1、琥珀酰胆碱2 mg•kg^-1经静脉注射进行麻醉诱导，异氟醚吸入、维库溴胺静脉注射维持麻醉。C组芬太尼0.004 mg•kg^-1、维库溴胺0.04 mg•kg^-1、咪唑安定0.1 mg•kg^-1、异丙酚2 mg•kg^-1、琥珀酰胆碱2 mg•kg^-1经静脉注射麻醉诱导，异丙酚、维库溴胺静脉注射维持麻醉。经口腔气管插管后接呼吸机持续机械通气，监测EtCO₂、气道压、ECG、无创BP、无创静脉血氧饱和度。
　　实验方法
　　病人进入手术室后在麻醉诱导前抽取血样，病人苏醒送回病房前再次经静脉抽取血样，所有血液样本送中心实验室经离心分离血清后冷藏于-20℃备用。
　　临床实验结束后，将全部血清取出自然解冻，酶联免疫法（ELISA法）检测sFasL的吸光度,与标准曲线对照后经计算得隅血清sFasL浓度。
　　ELISA试剂盒由MBL公司（Medical&Biological Labaratories Co LTD ,Japan）生产,苏州苏医生物基因技术有限公司提供.每个ELISA盒含有覆盖sFasL单克隆抗体的微孔板一块(96孔),sFasL标准液一份,洗脱液50ml,硫酸溶液18ml。
　　实验过程
　　标准制备：将sFasL标准液用100ml蒸馏水稀释至250ng•ml^-1，冷藏于-20℃备用。测试开始后复温，在常温下用蒸馏水1:49再次稀释至5 ng•ml^-1，再将该5 ng•ml^-1标准液稀释成1:1，1:2，1:4，1:8，1:16的系列标准，将该可溶性Fas配体标准系列稀释液各取双份（共12份）加入覆盖夺可溶性Fas配体单克隆抗体的96孔微孔平板中。

样本制备：样本经复温后取双份在常温下用试剂稀释液将每份样本1:16稀释，用多道毛细吸管将稀释后的样本液加入覆盖有sFasL单克隆抗体的96孔微孔平板中经充分反应后洗脱，加入抗sFasL单克隆抗体反应后再加入硫酸液中止反应,经洗脱后备用。
　　参数及统计方法
　　将终止反应反各样本双份血清在平板计数器中测量的数据结果取平均值，所测得的结果为吸光度，经与标准剂量反应参考曲线进行对照计算后得出sFasL浓度（μg•L^-1），各组间参数做方差分析，F检验。将所测得的麻醉前后结果进行自身对照，t检验。P值＜0.05表示差异有显著性。

结果

　42例受试者的麻酸平均时间为193.21±43.75（min）将中止反应后的96微孔孔平板置于450mm双波长平板计数器中检测光度。制成标准后所得的吸光度结果如表1，将该吸光度结果制成标准计量反应曲线（图1），做直线回归，计算相关性，r=0.9766,n=12,线性范围0.03～2.07。将测得的样本吸光度与标准曲线对照，计算每份样本中sFasL的浓度的浓度，在不同麻醉药物分组的病人中，A组麻醉前血清sFastL的浓度为0.093±0.039（μg•L^-1），麻醉后为0.1236±0.0536（μg•L^-1），p>0.05。B组麻醉前血清sFasL的浓度为0.0914±0.0343（μg•L^-1），麻醉后为0.1024±0.0479（μg•L^-1），麻醉后为0.1142±0.0518（μg•L^-1），p>0.05。三组合并，麻醉前血清中sFasL的浓度均为0.0922±0.0398（μg•L^-1），麻醉结束后的浓度平均为0.1134±0.0479（μg•L^-1），p<0.05。

讨    论

　　人Fas基因定位于第10号染色体长臂，有9个外显子，基因长度约12Kb，Fbs基因编码的跨膜蛋白由319个氨基酸（anino acia,aa）残基组成，分子量48KD，其分子结构分为膜外的N末端区和膜内的C末端区三个部分。Fas是一个早期的简介表示细胞调亡的信号，作为一种结合于细胞膜表面的特异蛋白，在正常生理状况下，广泛表达于各种类型的细胞表面，如活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、但和细胞、成纤维细胞、肾小球系膜细胞、内皮细胞、肝胆细胞、卵巢细胞及子宫内膜细胞等，在细胞相互作用过程中，作为细胞因子参与细胞的调亡过程。
　　现今的研究认为Fas抗原介导凋亡的机制是通过与之相应的配体(FasL)结合后发出凋亡信号，并传递至细胞核内，调节基因转录而诱导细胞凋亡，参与免疫应答调节和细胞生理代谢，在维持机体自身稳定中起负调控效应，是一种较早的间接反应细胞凋亡的信号^[2,3]。

　　FasL的基因定位于人和鼠的1号染色体，基因长度约８kb，由5个外显子组成，基因编码的蛋白质产物由281个aa组成，分子量约40kD，属于TNF家族的Ⅱ型跨膜蛋白。FasL在细胞膜表面合成后以膜结合蛋白的形式存在，其自身的分泌受到许多病理合生理因素的影像。FasL是Fas在生物体内的天然配体，Fas与Fasl结合是Fas在体内发挥作用的唯一途径，FasL主要表达于活的T淋巴细胞、自然杀伤（NK）细胞，当FasL（+）的细胞毒T细胞（CTL）与表达Fas的靶细胞接触，发出碉亡信号，触发靶细胞的程序性细胞死亡（PCD），参与免疫应答的调节和细胞生理代谢而发挥作用，Fas和Fasl的适当表达在维持生物体内的自身稳定中起着重要的负调控作用。
　  Fas-Fasl系统在体内有重要的生理功能，是一组调节组织发育和体内免疫平衡的重要分子，主要涉及免疫反应的下降调节和T淋巴细胞介导的细胞毒作用，并且与多种免疫性疾病、血液系统疾病和肿瘤的分化、生长、转移、介导凋亡以及炎症反应有密切关系。Fas-Fasl系统具有细胞毒作用，Fas（+）的CTL与Fasl相互作用启动凋亡并通过诱导激活细胞程序性死亡的机制在外周清除活化的T淋巴细胞，a-干扰素可以调节活化的外周血单核细胞中Fas和FasL mRNA的表达。
　  经细胞分泌后可以产生具有活性功能作用的sFas和sFas的分子，也可以在金属蛋白酶的作用下将以膜结合蛋白形式存在的Fas和sFasL胞外区蛋白裂解后脱落至细胞外形成可溶性单体即sFas具有免疫抑制活性功能，但也有研究认为可通过抑制Fas和FasL的结合来阴断凋亡中起着重要的下调作用。
　　正常人体血清中维持一定水平的sFasL，其血浆浓度水平大约是0.08-0.1ug•L^-1[5]，低氧状态可以影响sFas的浓度，低氧3-6小时其血浆sFasL浓度达到高峰值^[6]，应用酶联免疫吸附分析法检测发现年龄和血浆sFasL浓度无显著性差异。
　　各种不同的疾病包括恶性肿瘤人中血清sFasL水平有所增高，并且血清中sFasL较高的病人预后较sFasL在这些病人的临床症状的产生中起作用，也许对疾病的活动性具有指导意义。
　　有研究表明非肿瘤病人在硬膜外麻醉外手术前至手术后顾之忧4小时sFasL水平的比较未发现明显的变化，对于sFasL在胃肠道和脑血管手术中的变化目前尚无评价，但血清sFasL浓度在手术期间无变化^[10]，手术后轻微下降^[11]。本次实验通过对气管插管全身麻醉人（静脉和静脉吸入复合）在麻醉药物使用后外周血中sFasL浓度变化的观察发现，手术前人体内的循环sFasL浓度大约为0.0922ug•L^-1，与政党人群的浓度接近，并未受到紧张情绪的影响。手术结束后特环sFasL浓度大约为0.1134ug•L^-1，较手术前有所增高（Ｐ＜0.05），手术和麻醉药物以及机械通气可能对循环sFasL浓度影响的比较，未使用吸入醚组与使用吸入醚A、B组之间无明显差异。因此，在麻醉过程中各种麻醉药物对循环sFasL浓度的影响不明显，而手术前后循环sFasL浓度的变化，则可能还与机械通气过程中对肺泡上皮细胞的影响有关，尚待进一步的研究。

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