The Effects of intravenous Anesthetics on Erythrocyte Immune Adherence Function in Rats <?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

唐建国  主治医生 麻醉学硕士*
薛张纲  教授#
缪长虹  副教授#
* 复旦大学附属上海市第五人民医院麻醉科，上海 200240
#复旦大学附属中山医院麻醉科，上海 200032
Jianguo Tang, MD*， Zhanggang Xue, MD#， Changhong Miao, MD#
 *Department of Anesthesiology,Shanghai Fifth Hospital, Fudan University，Shanghai 200240 China;
 #Department of Anesthesiology,Zhongshan Hospital,Fudan University， Shanghai 200032 China

Abstract

Objective: To study the effects of different intravenous anesthetic agents on the activity of erythrocyte immunity in vitro.
Methods: Sixteen adult Sprague-Dawley rats were enrolled,from which anticoagulative erythrocyte suspension was made,and was incubated with equivalent volume of 1 time,2 times,4 times and 8 times of clinical therapeutic blood concentration of different intrvenous anaesthetics,respectively.Erythrocyte-yeast rosette rate(RYRR) and tumor-erythrocyte rosette rate(TRRR) were measured.
Results: Thiopental sodium with more than clinical theraputic blood concentration and more than 2 times of clinical theraputic blood concentration of ketamine significantly decreased the RYRR and TRRR(P<0.05,P<0.01),while propofol,midazolam and etomidate proved to be no significant effects on erythrocyte immunity(P>0.05). 
Conclusion:  Some intravenous anesthetics may give rise to evident inhibitory effects on erythrocyte immune adherence function in vitro via interfering with erythrocytes'metabolism and structure.
Key words: Anesthetics, intravenous; Immune, erythrocyte

　　手术、麻醉、麻醉药物及疼痛应激反应对手术病人细胞免疫、体液免疫及细胞因子的影响屡有报道^[1-3]，围手术期患者免疫功能的状态对术后病人的感染、肿瘤扩散及预后具有重大意义^[4]。近年来研究发现红细胞有许多与免疫有关的物质^[5]，在体内广泛参与非特异性和特异性免疫反应，在抗感染、抗肿瘤及自身稳定的免疫反应及调控中都具有重要作用。本文主要探讨常用静脉麻醉药物对离体鼠红细胞免疫黏附功能的影响。

材料与方法<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

一、材料制备
1. 红细胞悬液制备
　　选择成年SD大鼠16只，采取静脉血1ml，放入加有EDTA-2Na（20g?l^-l）的试管内，制成9:1的抗凝血，水平离心（2000rpm，5min）后提取红细胞，经红细胞计数器计数，用生理盐水将红细胞浓度调至1.25×10⁷/ml（A管）和1.0×10⁸/ml(B管)。
2．致敏酵母菌(Yc)(长征医院免疫室提供)
　　将补体致敏酵母菌移入试管内，生理盐水充分溶解，斜角离心（2000rpm，5min），倒出上清液，加生理盐水2ml，充分吹打开，按红细胞计数法配成1.0×10⁸/ml（C管）。
3．肿瘤细胞(艾氏腹水癌细胞)(长征医院免疫室提供)
　　将肿瘤细胞加蒸馏水在37℃水浴中充分吹打溶解，移入试管加8～９ml蒸馏水，充分混匀，2000rpm，5min，斜角离心，倒尽上清液，加1～1.５ml生理盐水，按白细胞计数法将肿瘤细胞调至1.0×10⁶/ml备用（D管）。
4．自身血浆制备
　　3.8%枸橼酸新鲜抗凝血离心后取上清液。

二、实验步骤
1．静脉麻醉药对红细胞免疫黏附酵母菌活性的影响
　　将Epindorff管编号（对照管、1、2、3、4号），加入A管液50ul，再分别加入生理盐水、4μg?ml^-1、8μg?ml^-1、16μg?ml^-1、32μg?ml^-1的异丙酚各50μl, 充分混匀，37℃水浴30分钟，加入C管液50μl混匀，37℃水浴30分钟，加生理盐水100μl、0.25%戊二醛50μl，取1/2反应液水平涂片，凉干后甲醇固定，用瑞氏染色液染色，高倍镜下计数，一个红细胞结上≥2个酵母菌为一朵花环，共计数100个红细胞，算出花环率。按上述方法，实验管中分别加入0.15μg?ml^-1、0.3μg?ml^-1、0.6μg?ml^-1、1.2μg?ml^-1的咪唑安定；20μg?ml^-1、40μg?ml^-1、80μg?ml^-1、160μg?ml^-1的硫贲妥钠；1.5μg?ml^-1、3μg?ml^-1、6μg?ml^-1、12μg?ml^-1的氯胺酮；0.35μg?ml^-1、0.7μg?ml^-1、1.4μg?ml^-1、2.8μg?ml^-1的依托咪酯，分别计算RYRR。
2. 静脉麻醉药对红细胞免疫黏附肿瘤细胞活性的影响
　　将Epindorff管编号（对照管、1、2、3、4号）编号，加入B管液50μl，1、2、3、4号分别加入上述浓度的静脉麻醉药各50μl，对照管加入生理盐水50μl，充分混匀，37℃水浴30分钟，加入D管液100μl、自身血浆50μl，37℃水浴30分钟，加生理盐水100μl、0.25%戊二醛50μl，轻轻混匀，取反应液水平涂片、甲醇固定、瑞氏染色液染色，高倍镜下观察结果，癌细胞结上≥3个红细胞为一朵花环，均衡计数100个癌细胞，算出TRRR。

三、统计方法
　　用SPSS10.0进行统计分析。实验所得结果用均值±标准差表示，用方差分析及Student Newman-Keuls统计处理，p<0.05有统计学差异。

结  果<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

临床血药浓度及以上浓度的硫喷妥钠及2倍以上临床血药浓度的氯胺酮对红细胞免疫黏附功能有明显抑制作用（P<0.05，P<0.01），研究浓度范围的异丙酚、咪唑安定及依托咪酯对红细胞免疫黏附功能无明显影响（P>0.05）（表 1）。

讨  论

    1981年美国生殖免疫学家Siegel^[6]在前人研究的基础上发现红细胞有多种免疫功能，提出了“红细胞免疫系统”的新概念。红细胞免疫黏附功能是红细胞免疫系统的重要组成部分，主要是通过红细胞补体受体I型（CR1、CD₃₅）而实现。CR1是C_3b、C_4b的天然受体，CR1是分子量为190k～250kD的多态性膜糖蛋白^[7]。每个红细胞的CR1约为200～1000个，而每个多形核白细胞（PMN）约有2500～6000个，因血循环中红细胞数量是白细胞的1000多倍，故推算CR1总数85%以上在红细胞上。有研究证实红细胞上大于3个CR1成簇状分布的占50%，PMN中不到15%，而成簇状分布的CR1才具有结合抗原或循环免疫复合物（CIC）的能力，抗原如某些细菌和肿瘤细胞可通过旁路直接激活和黏附C_3b，CIC可通过经典途径或旁路激活黏附C_3b，红细胞CR1通过C_3b黏附这些致病原和CIC，并迅速运送至网状内皮固定吞噬系统（FMS）加以清除。因此,红细胞对循环中的异己抗原的免疫黏附能力远超过PMN。本研究采用补体致敏的酵母均或自身血浆作为补体来源激活的肿瘤细胞与研究药物、红细胞共同作用，通过RYRR和TRRR了解红细胞免疫黏附功能及药物对其的影响。

　　麻醉对机体免疫系统的影响可包括麻醉药物对免疫细胞的直接影响和麻醉导致的机体应激反应造成的免疫功能的变化^[8]。Stevenson等^[9]研究认为硫喷妥钠、依托咪酯、氯胺酮能明显抑制机体的免疫功能。有研究认为^[10]异丙酚对离体淋巴细胞功能无明显影响。而硫喷妥钠、依托咪酯、氯胺酮均可不同程度地影响淋巴细胞抗体形成。不同的静脉麻醉药经静脉输注实施麻醉后，与红细胞直接接触，也可能对红细胞免疫黏附功能产生影响。因而本实验采用了与人红细胞免疫黏附功能相关性良好的豚鼠血红细胞作为研究对象，用1、2、4、8倍的临床血药浓度与等体积的红细胞悬液共同孵育，实验液终浓度为0.5、1、2、4倍的临床血药浓度，实验证实临床血药浓度以上的硫喷妥钠及2倍以上临床血药浓度的氯胺酮对红细胞免疫黏附功能有明显抑制作用，研究浓度范围的异丙酚、咪唑安定及依托咪酯对红细胞免疫黏附功能无明显影响。可能的原因为:
　　（1）麻醉药物对红细胞膜流动性的改变。细胞膜是由脂质双层分子构成的具有流动性的生物膜结构，受体蛋白象其它许多蛋白分子一样镶嵌在液晶态的脂质双分子层中，膜的稳定性对于维持受体的数目和功能起着重要作用。膜流动性明显增加或降低则可导致细胞膜结构的破坏和胞膜硬化，影响细胞膜的受体、酶蛋白和离子泵的正常生物学功能。红细胞膜的流动性不仅有利于红细胞通过毛细血管给组织供氧，也有利于红细胞膜表面的CR1成簇状分布，提高受体的亲和力，任何因素导致膜流动性下降都可影响红细胞免疫黏附功能^[11]。大多数静脉麻醉药都具有高度的脂溶性，易透入细胞膜或嵌入膜内与膜脂质或脂蛋白结合，使膜膨胀而改变膜脂流动性。Tsuchiya 等研究报道异丙酚可增加红细胞膜流动性，使其对抗过氧化及机械损伤引起的溶血能力增强。
　　（2）麻醉药对红细胞线粒体能量代谢的影响。有研究认为高浓度的巴比妥类静脉麻醉药及氯胺酮可抑制线粒体的电子传递而影响内呼吸功能；连文洁等[^13]在研究氯胺酮对小鼠红细胞免疫黏附功能的影响时发现，氯胺酮麻醉后小鼠CR1受体花环率明显下降、红细胞腺苷脱氨酶（ADA）明显受抑，并推断ADA活性下降导致细胞腺苷代谢障碍是氯胺酮影响红细胞免疫粘附功能的主要原因。
　　（3）麻醉药对膜结构的直接作用和膜蛋白离子泵的抑制。许多麻醉药可直接影响细胞膜蛋白-脂质的相互作用，从而影响膜上各种载体、受体、酶分子和离子泵的结构和功能。Ca²⁺在维持红细胞膜的稳定性和变形能力方面起重要作用，有研究认为异丙酚通过有效的清除自由基维护膜蛋白酶的正常功能，防止Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶失活和细胞内的Ca²⁺超载^[14]，异丙酚的化学结构和维生素E、丁羟基甲苯结构类似，具有抗氧化作用的酚结构。吴新文等^[15]认为咪唑安定也有较强的抗氧化能力，也具有良好的细胞膜保护作用。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

参 考 文 献

1. Hole A.Depression of monocytes and lymphocytes by stressrelated humoral factors and anaesthetic-related drugs.Acta Anaesthesiol Scand, 1984,28(3): 280-286.
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3. Pirttikangas CO, Salo M, Peltola O.Propofol infusion anaesthesia and the immune
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4. Hanshrough JF.Alterations in splenic lymphocyte subpopulations and increased mortality from sepsis following anesthesia in mice. Anesthesiology, 1985,63(3): 267-73.
5. 唐建国，薛张纲.红细胞免疫系统研究进展.中国临床医学，2002，9 （5）: 593-596.
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7. Lach-Trifilieff E,Marfurt J,Schwarz S,et al.Complement receptor 1 (CD35) on human
reticulocytes: normal expression in systemiclupus erythematosus and HIV-infected patients.J Immunol,1999; 162(12): 7549-54.
8. Moudgi CG.Update anesthesia and immune response.Can Anesth Soc J,1986,33: S54-60.
9. Stevenson GW,Hall SC,Rudnick S,et al.The effects of anesthetics agents on human  immune response.Anaesthesiology,1990,72: 542-545.
10. 李军，奚家骅，杨晋祥.异丙酚体外对人外周血淋巴细胞功能的影响.中华麻
     醉学杂志，1995，15（9）: 414. 

　　唐建国，男，1968年出生，1993年毕业于上海医科大学，获医学学士学位；2002年毕业于复旦大学上海医学院，是从复旦大学附属中山医院麻醉学薛张刚教授，获麻醉学硕士学位，现为复旦大学附属上海市第五人民医院麻醉科主治医生，科室副主任。已发表学术论文12篇。