Effects of EGF om the Expression Characteristics of Phosphorylated MAPK in Rat Small Intestine after Ischemia-reperfusion Injury<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

邢 峰 Feng Xing
解放军第二炮兵总医院麻醉科，北京100088
Department of Anesthesiology,the Second Artillery General Hospital of FLA Beijing 100088
郭宝琛 Baochen Guo
解放军第304医院麻醉科，北京100037
Department of Anesthesiology,the 304  Hospital of PLA Beijing 100037
付小兵 Xiaobing Fu
解放军第304医院创伤修复实验室，北京100037
Trauma Research Institute，the 304  Hospital of PLA， Beijing 100037

　　　　　　　　　　　　　       ABSTRACT
Objective:To investigate the effects of EGF on the expression characteristics of phosphrylated MAPK in EGF-induced gut repair after ischemia-reperfusion(I/R)insult.
Methods:80 Wistar rats were randomly divided into four groups,namely EGF treated group(E),normal saline control(R),ischemia group(I)and sham operated control(C).In group E and R,the rats were treated with intravenous EGF 100μg/kg/rat or normal saline respectively.Blood samples were collected at 2,6,12and 24hours after reperfusion and plasma D-lactate were determined.Intestine samples were taken for histological analysis and immunohistochemical analyis of  phospho-p44/42 MAPK, SAPK and p38.
Results: (1)The changes of histological structure and plasma D-lactate indicated that the intestinal barrier was damaged after intestinal I/R injury. EGF treatment significantly improved the outcome. (2)phospho-p44/42 MAPK positive cells increased in group I and R,but more significantly in group E.(3)phospho-SAPK were poorly expressed in all groups.I/R insult moderately increased its expression,but weakened in group E.(4)The expression of phoshho-p38 increased with the time of reperfusion and reached its peak at 12 hours of reperfusion. EGF treatment brought forward its expression.
Conclusions: MPAK pathway was activated after intestinal I/R insult, which might play an important role in EGF-induced gut repair.
Key Words: MAPK(mitogen-activated protein kinase); Small intestine; Ischemia-Rreperfusion injury; Rat

　　丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activaed protein kinase，MAPK）在表皮生长因子（EGF）等引起的细胞反应中起重要调控作用^[1]。MAPK包括p44/42MAPK、SAPK和p38等多种亚型。体外研究证实，EGF可以通过激活p44/42MAPK 通路促进小肠细胞细胞的增殖反应^[2-4]，p38与细胞的炎症反应、细胞增殖、分化以及凋亡关系密切^[5]，而SAPK主要与凋亡有关，但在肠缺血-再灌注（I/R）后的表达特征尚未见相关报告。本实验利用大鼠肠I/R损伤模型，给予大鼠静脉注射EGF，观察D-乳酸浓度的变化规律以及相应的病理学改变，用免疫组织化学方法研究肠I/R引起的磷酸化p44/42 MAPK、SAPK和p38的表达规律以及EGF对其表达的影响，进而探讨MAPK在创伤修复中的作用。

　　　　　　　　　　　　　　　  材料和方法

一、材料
　　雄性Wistar大鼠，体重200~250g（购自军事医学科学院动物中心），随机分为对照组（C），肠缺血组（I）、肠缺血-再灌注组（R）和EGF治疗组（E）。根据缺血后再灌注时间的不同将R组和E组又分成2,6,12和24h共4组，每组8只动物。

二、方法
  　采用肠系膜上动脉（SMA）夹闭-松夹方式制成肠缺血-再灌注模型。大鼠腹腔注射30g/L戊巴比妥钠（35mg/kg）麻醉后，取腹正中切口3-4cm，钝性分离SMA根部。E组和R组动物以血管夹夹闭SMA根部，完全阻断血流45min之后放松血管夹，使肠道血流恢复形成再灌注，在松开动脉夹的同时经右颈静脉注入EGF100μg/kg（由中国科学院上海生物化学研究所提供）或生理盐水0.5mL。C组仅分离SMA不作夹闭，I组不注射EGF或生理盐水。按照设定时间点取门静脉血离心后分离血浆，－ 80℃保存，用酶联紫外分光光度法测定血浆D-乳酸水平。取肠道经40g/L甲醛固定、石蜡包埋后切片、HE染色，光镜下观察。应用PowerVision^TM二步法进行免疫组织化学研究。采用的试剂包括：磷酸化p44/42 MAPK，SAPK和p38小鼠单克隆抗体（Cell Signaling Technology，Inc. ，美国），第二抗体（北京中山生物技术有限公司），DAB（二氨基联苯胺，福州迈新生物技术公司）。按照试剂说明书要求进行免疫组织化学技术操作。石蜡切片按常规脱蜡至水，在体积分数为30ml/L H₂O₂中孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗，置于0.01mol/L，pH6.0的枸橼酸盐缓冲液中行抗原热修复后，滴加按1∶100稀释的一抗，37℃孵育40min。PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，37℃孵育20min，PBS漂洗后DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明封片。另用PBS代替一抗做阴性对照。

三、观测指标
  光镜下观察阳性细胞在小肠粘膜的分布，以细胞浆和/或细胞核着棕色者为阳性染色。每只大鼠观察50个纵向切开的隐窝和绒毛（隐窝腔和绒毛应保持完整），统计阳性细胞百分数率。相对定量结果判定：在目镜为10倍，物镜为40倍的条件下，根据视野内阳性信号表达程度分为阴性（－）、弱阳性（+）、阳性（++）和强阳性（+++）。阴性为视野内无阳性信号表达，弱阳性为视野内可见10个以下的阳性颗粒，阳性为视野内阳性颗粒11~30个，强阳生为视野内阳性颗粒多于30个。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

四、统计学分析
　　研究数据以均值±标准差表示，SAS软件包统计各组间差异，P＜0.05为有显著性差异。

　　　　　　　　　　　　　　　      结　果
  　大鼠SMA夹闭后，肠道明显变紫，蠕动减慢。HE染色见粘膜上皮出现充血、水肿和炎细胞浸泣以及糜烂、坏死，以伤后6h最明显，在再灌注后24h基本恢复正常的粘膜结构，E组动物肠粘膜损伤的程度较R组明显减轻。
  　血浆D-乳酸浓度的变化：再灌注2h和6h，各组动物血浆D-乳酸浓度较假手术组均显升高，但R组升高的幅度显著高于E组（P＜0.01或P＜0.05，表1）。
  　磷酸化p44/42 MAPK表现为散在分布于胞质内的棕色颗粒，大部分靠近细胞核，少量细胞有核内表达。在灌注后几乎全部绒毛上皮细胞和隐窝细胞表达磷酸化p44/42 MAPK，随着再灌注时间的延长，核内表达的比例增加。E组绒毛上皮细胞和隐窝的阳性细胞数量均高于R组相应时相点，核内表达的比例也高于R组（表2）。
  　磷酸化SAPK存在于小肠隐窝及小肠绒毛上皮细胞的胞浆内及胞核中，在正常肠道中表达极低，I/R损伤后，表达量略有增加。E组磷酸化SAPK的表达较R组减弱（表3）。
  　磷酸化p38在C组和I组大鼠小肠中每个隐窝仅有5~6个阳性细胞，主要在隐窝的下1/2。再灌注后2小时阳性细胞数量有所下降，在6小时隐窝底部的阳性细胞显著增多，主要为细胞核着色，胞浆中也可见棕色颗粒。E组的表达于再灌注后2h开始增加，表达量较R组差别显著（表4）。

　　　　　　　　　　　　　　     讨　论
  　MAPK的各种亚型在胞浆内广泛分布，与细胞的增殖、凋亡与分化有关，可以被脂多糖（LPS）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1（IL-1）等多种因素激活。I/R损伤可迅速激活MAPK，作为早期细胞内信号参与细胞对应激反应的调节。EGF与其受体（EGFR）结合后，经过中间途径激活MAPK，最终导致细胞的增生反应和抗应激反应^[5]。
  　

  　在EGF 等生长因子刺激引起的细胞反应中起重要调控作用。在心、肾、肺等多种组织中，均发现I/R损伤可迅速激活MAPK信号传导通路^[6]，作为早期细胞内信号参与细胞对应激反应的调节。一般认为I/R时p44/42 MAPK活性的增加是细胞针对缺氧刺激启动修复过程、促进细胞存活的保护性机制，对于经历了I/R损伤的细胞具有保护作用^[7]。EGF与其受体（EGFR）结合后，通过中间环节激活MAPK，后者进入核内，通过中间反应物介导原癌基因c-myc、c-fos、c-jun等的产生和磷酸化，影响下游基因的表达^[8，9]。

  　本实验中，I/R损伤持续激活p44/42 MAPK和p38，使其参与了I/R引起的应激反应。值得注意的是，无论在绒毛还是隐窝，核内表达磷酸化p44/42 MAPK的细胞数量均随再灌注时间延长而增加，而进入核内是p44/42 MAPK发挥促进细胞增殖作用的前提。外源性EGF使p44/42 MAPK和p38被激活的时间提前，而且持续时间也延长。由此看来，EGF促进了p44/42 MAPK 和p38的早期激活和核转位，而发挥对肠粘膜损伤的保护作用。
  　因此，外源性EGF减轻I/R引起的肠道损伤的作用可能与对MAPK的调节有密切联系有必要继续深入研究其机制。

参考文献
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