The Neuroprotective Effect and Mechanism of Propofol on Neuronal Damage Induced by Ketamine in the Rat Posterior Cingulate Cortex<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

郭建荣 杜金满 谢道奋 任利远 余雷霆 李颂
宁波大学医学院附属李惠利医院麻醉科，宁波 315041，浙江
Jian-Rong Guo，Jin-Man Du，Dao-Fen Xie，Li-Yuan Ren，Lei-Ting Yu，Song Li．
Department of Anesthesiology，Lihuili Hospital，Medical School，Ningbo University，Ningbo 315041，Zhejiang, China

ABSTRACT

　　Objective：To investigate the effects of propofol on ketamine-induced c-fos mRNA and protein expression in the rat posterior cingulate cortex，and to explore the possible mechanism of using propofol to prevent or treat ketamine-induced psychotomimetic effects and neuronal damage．
　　Methods：Thirty male Wistar rats weighing 250-300g were randomly assigned to five groups with six animals each：Group 1 received normal saline 5ml intraperitoneally ip (NS)；group 2 received ketamine 100mg•kg^-1 ip (K)；group 3 received propofol 100mg/kg ip (P)；group 4 received propofol 50mg•kg^-1 + ketmaine 100mg•kg^-1 ip(P₁K) and group 5 received propofol 100mg•kg^-1 + Ketamine 100mg•kg^-1 ip (P₂K)．In group 4 and 5 the interval between propofol and ketamine administration was 15min．Two hours later，the animals were decapitated and brain was removed．c-fos mRNA  expression in the posterion cingulate cortex was detected by using semi-quantitative RT-PCR technique；c-fos protein expression in posterior cingulated cortex was determined by  immuno-histochemical method．
　　Results：The levels of c-fos mRNA and c-fos protein expression were significantly different among the 5 groups．Ketamine induced marked c-fos mRNA and c-fos protein expression in the posterior cingulate cortex．Propofol itself did not induce c-fos gene expression in this brain region．Propofol significantly inhibited ketamine-induced c-fos mRNA and c-fos protein expression in the posterior cingulated cortex in a dose-dependent manner．
　　Conclusions：Propofol pretreatment can significantly inhibit ketamine-induced c-fos mRNA and protein expression in the posterior cingulate cortex．It may be one of mechanisms of inhibition of ketamine-induced psychotomimetic effect and neuronal damage by propofol．
　　Key words: Propofol；Ketamine；c-fos gene；Posterior cingulate cortex
　　Corresponding author: Jian-rong Guo，MD，PhD；E-mail address：guomzk@yahoo.com.cn

　　氯胺酮为一非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗药，在临床应用时常会引起恶梦和幻觉等不良精神症状。研究发现，氯胺酮可诱导各脑区尤其是后扣带回皮质区和胼胝体压部皮质区c-fos蛋白的异常表达，并可导致这一部位的神经元产生空泡性损害。此部位亦是精神分裂症发作相关部位，故认为氯胺酮所引起的不良反应可能与此区域损伤有关^[1]。本研究通过观察氯胺酮诱导的c-fos基因在大鼠后扣带回皮质区的表达及异丙酚对其表达的影响，探讨异丙酚预防或减轻氯胺酮所致精神症状及神经损害的可能作用机制，为临床合理用药提供理论依据。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

材料与方法

1. 主要仪器与试剂
　　Biometra PCR扩增仪（德国），Kodak ID型凝胶成像分析系统（美国），紫外分光光度计（日本），杜邦T₂₁低温高速离心机（美国），超低温冰箱（美国Forma），德国Leica切片机，日本Olympus显微镜，Metamorph显微图像分析系统（日本）；c-fos免疫组化染色试剂盒（Boster生物工程有限公司）；DEPC（Sigma公司），总RNA抽提试剂盒（Trizol Reagent，Gibco），RT-PCR（TaKaRa生物工程有限公司），异丙酚（CA742，英国AstraZeneca）。

2. 实验动物与分组
　　健康雄性Wistar大鼠30只，体重250～300g，由中国医科大学实验动物中心提供（动物合格证：2002008）。全体动物实验前适应实验室环境2周，室温保持22℃～24℃，自由进食和饮水。动物随机分为5组：生理盐水5ml(NS)组；氯胺酮100mg•kg^-1(K)组；异丙酚100mg•kg^-1（P）组；异丙酚50mg•kg^-1-氯胺酮100mg•kg^-1（P₁K）组；异丙酚100mg•kg^-1-氯胺酮100mg•kg^-1（P₂K）组；每组大鼠6只。异丙酚与氯胺酮两药间隔15min，所用药物用生理盐水稀释至5ml经腹腔注射。实验过程用电灯泡和电热毯保温，用热敏温度探头连续测定肛温，保持大鼠直肠温度在37℃±0.5℃。各组动物于用药后2h断头处死，在-20℃冰玻上迅速分离出大脑后扣带回皮质，置于液氮中冷冻，-80℃保存待测。在视交叉后1mm及4mm处冠状面切开鼠脑，取中间块放入10%中性甲醛缓冲液中固定，石蜡包埋。
3. 半定量逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）检测
　　所用引物由中科院上海生化所合成，c-fos基因（348bp）上游引物：5′-ATGATGTTCTCGGGTTTCAA-3′，下游引物：5′-TGACATGGTCTTCACC ACTC-3′；γ-actin基因(287 bp)上游引物：5′-ATGGAAGAAGA AAT CGCC GC-3′，下游引物：5′-ACACGCAGCTCGTTG TAG AA-3′。RT-PCR检测按Gibco公司Trizol Total RNA Isolation Reagent说明书提取后扣带回皮质总RNA。紫外分光光度仪测定RNA浓度，琼脂糖电泳证实RNA完整性。半定量RT-PCR采用γ-actin为内参照，逆转录参照TaKaRa公司逆转录说明书进行。阴性对照用每个样本直接行PCR，不加引物或模板。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相，用计算机凝胶成像分析系统进行密度扫描定量，用c-fos基因扩增产物的密度与γ-actin基因（看家基因，含量稳定，不受外界刺激影响，因此作为内参照）扩增产物的密度比值，表示c-fos mRNA的表达量。
4. 免疫组化检测
　　沿鼠脑的冠状面连续切取5μm厚切片30张，每隔5张选取1张切片，用Boster公司推荐的SABC法进行免疫组化染色，DAB显色，PBS终止反应，苏木素复染，中性树胶封片。每组各有1张切片用0.1%PBS代替c-fos单克隆抗体，做为免疫组化的阴性对照，镜下观察胞浆或胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞，每张切片在后扣带回皮质区任选6个高倍视野，用彩色显微图像分析系统检测c-fos阳性细胞的百分率、阳性细胞的密度及灰度值。
5. 统计学处理
　　所得数据用均数±标准差（）表示，采用SPSS11.0统计分析软件进行数据处理，计量资料用t检验及单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为差异有显著性，P<0.01为有极显著性差异。

结　果<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

1. c-fos基因mRNA的表达
　　经紫外分光光度计测定提取的总RNA  A260/A280的值1.6～1.9，说明提取的总RNA纯度良好。利用选定的逆转录条件和设定的两对引物对30份标本进行检测，得到c-fos 348bp和γ-actin 287bp的扩增产物。内参照γ-actin在287bp处亮度均衡，在各反应体系中扩增结果基本一致，证实PCR反应基本真实地反应了c-fos mRNA在后扣回皮质区的表达。研究结果显示，K组c-fos mRNA的表达水平明显高于其它各组（P<0.05）；NS组呈极低水平的表达；P组不能诱导c-fos mRNA的表达；异丙酚预处理组的c-fos mRNA表达水平明显低于K组，并呈剂量依赖性（图1）。

2. c-fos基因蛋白的表达

　　c-fos蛋白表达的信号为棕黄色，多出现于神经纤维或神经细胞浆及细胞核内。研究结果显示，对照组与其它各组比较，后扣带回皮质区c-fos阳性细胞的百分率、阳性细胞密度和灰度值存在着显著性差异（P<0.01）。灰度值越小，表示阳性产物c-fos表达越强烈。单纯氯胺酮可明显诱导c-fos阳性产物在大脑后扣带回皮质区的异常表达；异丙酚自身不能诱导c-fos蛋白在此区域的表达；生理盐水组仅呈弱阳性表达；异丙酚预处理组的阳性信号表达强度明显低于K组（P<0..01），异丙酚可明显下调氯胺酮诱导的c-fos蛋白在大脑后扣带回皮质区的异常表达（表1）。

讨　论

　　氯胺酮属苯环己哌啶类静脉麻醉药，也是NMDA受体拮抗药，对中枢神经系统有选择性作用，可抑制大脑联络径路和丘脑新皮层系统，兴奋边缘神经系统，由于边缘系统与情感有关，故认为氯胺酮麻醉后的精神症状可能与此有关。临床观察表明，单纯使用氯胺酮的病人常会出现类似精神分裂症的精神症状，如幻觉、谵妄、恶梦等，表现在认知方面的损害和行为异常，在一定程度上限制了该药在临床上的使用。目前，对氯胺酮所致不良反应的机制尚未阐明。一般认为与氯胺酮自身导致的后扣带回和胼胝体压部皮质区神经元损害有关^[1]。临床上常将氯胺酮与其他静脉麻醉药如异丙酚、安定类等药物复合应用，以增强氯胺酮的麻醉效果和/或减轻其所产生的不良反应。实验与临床研究均表明，异丙酚对中枢神经系统具有一定保护效应。临床观察发现，异丙酚确可增强氯胺酮的麻醉作用，并可减轻氯胺酮兴奋边缘系统所诱发的不良反应，但对其确切作用机制尚不是十分清楚。

参 考 文 献<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

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　　作者简介：郭建荣，医学博士，副教授，副主任医师，硕士生导师。现任宁波大学医学院附属医院，宁波市医疗中心李惠利医院麻醉科主任，学科带头人。美国麻醉医师协会会员，欧洲麻醉协会会员，浙江省麻醉学会常委，宁波市麻醉学会副主任委员，已发表学术论文20余篇，参编专著3部，现主持科研项目3项。