The Effects of Hemodilution on Changes of the Pathology and Concentration of Amino Acids at Different Brain Areas after Deep Hypothermia Circulation Arrest of Rats<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

苏殿三　王祥瑞　郑拥军　赵延华　张挺杰

SU dian-san, WANG xiang-rui, ZHENG yongjun, et al.

Institute Of Anesthesiology Renji Hospital, Shanghai Second Medical University , Shanghai 200001, China.

Abstract

Objective：To develop a rat model of deep hypothermia circulation arrest(DHCA) and to observe the effects of hemodilution on Changes of the Pathology and Concentration of Amino Acids in Different Brain Areas after DHCA. 

Methods：48 rats were distributed randomly into four groups: Hematocrit(Hct)10% group , Hct20% group,Hct30% group and control group, 12 rats in each group. All experiment groups underwent 90 minutes of DHCA at 18℃. After then we measured the changes of the pathology, and evaluated  the concentration of Glutamate(Glu) , Aspartate(Asp) , Glycine(Gly), γ-Aminobutyric Acid(GABA) and Taurine(Tau) with the high performance liquid chromatograpy.

Results：The numbers of injury neurons in the hippocampus and parietal cortex but not in the thalamus of the Hct 30% group were significantly greater than those of other groups (p<0.05). Although the concentration of the said five amino acid all increased after DHCA, the concentration of the Glu, Asp and Gly in the hippocampus and parietal cortex but not in the thalamus of the Hct 30% group were significantly less than  those of other groups (p<0.05). However, the concentration of the GABA and Tau had no significant difference among the three experiment groups.

Conclusions：Maintaining Hct of 30% would attenuate the brain injury after DHCA, and the mechanism of this neuroprotective effects may contribute to the inhibition of the concentration of the excitatory amino acids in the brain.  

Keywords：Hemodilution;  Deep Hypothermia Circulation Arrest; Amino Acid; Brain; Rats

深低温停循环（DHCA）是临床大血管手术、巨大脑动脉瘤手术时常用的技术，但是术中的最佳血液稀释程度一直没有定论。因此，本研究观察了不同程度血液稀释对大鼠DHCA模型不同脑区病理学和氨基酸浓度变化的影响，以探讨不同血液稀释程度与DHCA后脑损伤的关系。

材料和方法<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

1.动物及分组

成年健康雄性SD大鼠48只，体重400～450g(中科院上海动物中心提供)，随机均分为四组，每组12只动物：Hct10%组 ；Hct 20%组；Hct30%组和对照组。前三组为实验组，控制体外循环预充液的构成，将转流后动物Hct分别控制在相应的水平，对照组动物只作假手术，不行体外循环，麻醉时间与实验组相同。

2. 制作大鼠DHCA模型

（1）CPB的构成和监测

CPB环路由20^＃压力注射管连接储血器（10ml注射器）、血泵（兰格蠕动泵BT00-100M/YZ1515）和氧合变温器（中空纤维膜式氧合器，氧合面积为0.1m²，变温面积0.03m²，预充量为8ml，上海复旦大学生物材料有限公司提供）组成。预充液总量为20ml。Hct30%组的预充液为全血10ml、乳酸林格氏液4ml、20%甘露醇1ml、肝素1ml（100UI）、6%贺斯4ml；Hct20%组预充液为乳酸林格氏液10ml、20%甘露醇1ml、肝素1ml（100UI）、6%贺斯8ml；Hct10％组预充液成分与20%组相同，但是在转机开始前抽血10ml并同时补充乳酸林格氏液和贺斯（1:1）混合液10ml。连续测量动物直肠温度、心电图（ECG）、心率（HR）、平均动脉压（MAP），血气分析仪测定股动脉血氧分压（PaO₂）、pH值、红细胞压积（Hct）、颈静脉血氧饱和度（SjvO₂）和血乳酸（Lac）。

（2）动物模型的制作过程

术前20min肌肉注射阿托品0.03mg/kg。腹腔注射混合麻醉药2.4ml/kg（芬太尼0.005%，氯胺酮5%，氟哌利多0.25%）诱导并行气管插管，麻醉仍以该复合液维持。插管后的大鼠实行机械通气，呼吸频率60次/min，潮气量为8ml/kg。

分离并穿刺双侧股动脉，一侧连接动脉测压系统，另一侧用于动脉灌注。分离并穿刺右侧颈内静脉，以监测颈内静脉的血气。分离右侧颈静脉，以末端带有侧孔的14G静脉留置针穿刺（深度为3.5cm左右），使头端到达右心房水平。穿刺成功后立即开始体外循环转流（Hct10%组在转流前抽血10ml同时补充乳酸林格氏液和贺斯（1:1）混合液10ml）。转流开始时灌注流量为10ml.min^-1，逐渐将灌注流量逐渐加大到约50ml.min^-1。转流开始后停止机械通气。

调节变温水箱的温度，在20min内将大鼠的体温降到18℃，停止体外循环90min，依靠体表降温维持深低温状态，然后在30min内将温度复到(36～37) ℃，停体外循环，恢复机械通气，保持循环呼吸稳定60min视为成功。假手术对照组仅作各种插管，不进行体外转流。

模型制作成功后，一半动物经灌注固定后取脑组织待测，另外一半动物不灌注直接断头取脑置入液氮保存待测。

3.反相高效液相色谱法检测氨基酸的浓度<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

分离液氮保存的鼠脑额顶叶皮层、海马和丘脑三部分的脑区，称重后加入两倍体积0.1M高氯酸（Hclo₄）按文献1中介绍的方法检测谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、γ氨基丁酸（GABA）和牛磺酸（Tau）5种氨基酸的浓度^[1]。

4.病理

取固定在4%多聚甲醛中的标本参考图谱^[2]，在鼠脑的腹侧面以视交叉为标志，在视交叉处作冠状切面，然后在视交叉向尾侧5mm处再作一切面，取中间的脑组织作常规石蜡包埋、切片和HE染色。HE染色结果应用Leica DMBL图像分析系统分析400倍下，在109634像素的固定区域计数各个脑区受损神经元的个数，每张切片计数5个视野，每只动物计数5张切片。

5.统计学分析

计量数据采用表示，组间比较采用方差分析，应用SPSS10.0 软件进行统计。P<0.05为有统计学差异。

结果

1. 术中血气检测的结果

各项指标的变化和临床的情况很接近，主要表现为复温复灌开始时的酸中毒。各实验组的pH值在复温复灌开始时均明显下降，3个实验组两两比较的结果表明下降的程度以Hct10%组最低,其次是Hct20％组，Hct30%组最高，与正常值最接近（p<0.05）。在复温复灌开始时的血乳酸（Lac）浓度在3个实验组均升高，两两比较的结果表明，Hct10%组最高,其次是Hct20％组，Hct30%组最低（p<0.05）。其它血气监测指标（除Hct外）在三个实验组之间未见明显差异。结果见表1。

2病理检查结果

DHCA（18℃，90min）后在观察的脑区均出现数量不等受损神经元，这些神经元主要表现为细胞核浓染、变性、形态多种多样，细胞浆减少或者消失（见图1－10）。DHCA后造成的脑损伤以丘脑部分最轻，并且其病理表现在3个实验组之间没有明显差异（p>0.05）。而皮层和海马的损伤较重，3个实验组两两比较的结果表明，Hct30%组最轻，Hct10%组最重，Hct20%组居中（p<0.05）（结果见表2）。

兴奋性氨基酸的毒性作用主要指谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）的毒性作用^[8]。谷氨酸是脑内的主要神经递质，与很多神经生理功能有关，包括认知、记忆、运动和感觉等。Glu和Asp都是通过与谷氨酸受体结合后发挥作用的。谷氨酸受体包括两种类型，代谢型与离子型，前者通过与G蛋白耦联发挥作用，后者则直接与离子通道相结合。离子型谷氨酸受体主要有NMDA受体和AMPA受体。Glu和Asp与NMDA受体结合需要一个协同激活因子甘氨酸（Gly），Gly本身是一种抑制性氨基酸，但它是激活NMDA受体必须的。NMDA受体激活以后可以产生瀑布式的连锁反应，包括蛋白激酶、核酸内切酶、磷酸激酶和一氧化氮合酶激活，过氧化物形成，最后导致DNA降解和神经元死亡。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

本研究发现，DHCA后各个脑区Glu和Asp的浓度均升高，提示DHCA后的脑损伤机制中有兴奋性氨基酸毒性作用参与。这与Tseng EE等的研究结果一致^[8]。同时本研究还发现，在海马和皮层两个脑区，兴奋性氨基酸Glu和Asp及抑制性氨基酸Gly的浓度在Hct30%组最低，说明较高Hct值的脑保护作用与抑制兴奋性氨基酸升高，减轻兴奋性氨基酸的毒性作用有关。但是有趣的是，在丘脑这3种氨基酸的浓度在各个实验组之间没有明显的差异，其原因有待于进一步研究。

Glu主要存在于神经末稍内Glu囊泡中，末稍去极化兴奋时释放到突触间隙，作用于突触后膜的特异性谷氨酸受体，完成兴奋性突触传递作用。Glu自身因酶解、神经元和胶质细胞重摄取而被迅速清除，终止其作用。其中重摄取是中枢神经系统终止内源性Glu兴奋作用的主要机制，但这种重摄取过程是依赖能量的。当脑缺血时，ATP合成不足，重摄取发生障碍，导致局部Glu大量积聚，持续作用于受体，引发兴奋性氨基酸的毒性反应 ^[9]。目前为止还没有血液稀释直接影响氨基酸浓度的证据，因此我们推测，在DHCA期间保持较高的Hct可以增加脑循环携氧能力，减少脑组织的缺氧程度，增加脑组织局部可以利用的ATP量，增加谷氨酸的重新摄取，因此减轻了兴奋性氨基酸的毒性作用。

GABA和Tau是抑制性氨基酸。GABA的主要生理功能是突触前抑制兴奋性递质的释放。脑缺血后GABA和Tau升高认为是一种自我保护作用^[11-12]。本实验发现，DHCA后3个脑区GABA和Tau浓度都明显升高，但是3个实验组之间没有显著性差异，其原因还有待于进一步研究。

总之，在DHCA过程中将Hct值保持在30%左右具有减轻脑损伤的作用，并且这种保护作用的机制与抑制兴奋性氨基酸升高有关。

参考文献

1.顾拥军,倪文,包维丽,等. 反相高效液相色谱荧光法测定氨基酸类神经递质.上海医科大学学报,1995, 22:210-212.

2.包新民，舒斯云,主编.大鼠脑立体定位图谱.人民卫生出版社，1991.32-50

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7.Lipton SA, Rosenberg PA. Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders. N Engl J Med, 1994,330:613?622.

8.Tseng EE, Brock MV, Kwon CC,et al. Increased intracerebral excitatory amino acids and nitric oxide after hypothermic circulatory arrest. Ann Thorac Surg 1999;67(2):371-6

9.Nishizawa Y.Glutamate release and neuronal damage in ischemia. Life Sci, 2001,69:369-381.

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11.Khan SH, Banigesh A, Baziani A,et al.The role of taurine in neuronal protection following transient global forebrain ischemia. Neurochem Res, 2000,25:217-223.