郑拥军　王祥瑞　苏殿三　赵延华<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

上海第二医科大学附属仁济医院麻醉科,上海　200127

文献报道证实丙泊酚（Propofol，异丙酚）有较好的脑保护作用^[1，6]。但是临床应用丙泊酚产生脑保护作用的同时，往往导致显著的心血管系统抑制^[2]。因此对于老年患者、心衰和危重病人，丙泊酚围术期应用受到了限制。与静脉输注相比，丙泊酚颈内动脉注射用药剂量小，颅内浓度高，且无循环系统明显抑制。本研究通过比较丙泊酚静脉和颈内动脉输注对大鼠体外循环下神经元凋亡、凋亡相关基因bax和bcl-2 mRNA和蛋白表达以及循环功能的影响，对丙泊酚动脉输注的药效动力及脑保护研究开展新的探索。

材料和方法

1 体外循环模型建立

雄性SD大鼠50只，4～6月龄，体重380～420克（由上海中科院动物实验中心提供），动物的使用符合动物保护有关条例。动物在实验前自由进食和饮水。大鼠体外循环模型根据Mackensen GB等人^[3]建立的模型作适当修改。麻醉前用药为阿托品肌注0.02mg.kg^-1，麻醉采用异氟谜4%～6%诱导，随后以1.5%～2.0%维持麻醉，麻醉后经口气管插管（14G套管针），行机械通气（频率60次/分，气道峰压9.0cmH₂O），腹腔注射维库溴铵0.1mg.kg^-1。

左侧股动脉穿刺置入22G套管针，肝素化（500u.kg^-1）后监测动脉压及动脉血气；20G套管针置入尾动脉作为心肺转流（cardiaopulmonary bypass，CPB）的灌注端；用前端刻有数个侧孔的14G套管针经右颈静脉插至右心房-下腔静脉交界处作为CPB流出端，依靠40cm落差可充分引流下腔、上腔及冠状窦静脉血。CPB环路由贮血器、恒流蠕动泵、大鼠微型膜氧合器及连接管道组成。CPB采用无血预充20ml，由乳酸林格液12ml、6％羟乙基淀粉7ml及甘露醇1ml组成。CPB期间，适量1:1晶胶液加入贮血器维持贮血器血液量2～3ml。

CPB开始灌注量100 ml/kg/min，经变温室10℃循环水使直肠温降至26℃～28℃，随后转流量调整为160 ml/kg/min，氧流量0.2～0.5 L/min， CPB结束前20分钟，42℃水经变温室复温至直肠温36℃，总转流时间2小时。CPB开始后30分钟，经贮血器加入芬太尼50/g/kg、异氟谜1.5%～2.0%输注以维持麻醉深度。酸碱平衡管理采用α稳态，维持动脉血pH值7.35～7.45，PCO₂ 35～45mmHg。根据不同分组，保持大鼠麻醉状态和机械通气1小时，然后取脑组织。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

2 实验分组

50只大鼠随机均分为假手术组（Non-CPB组），体外循环组（CPB组）, CPB＋propofol 2mg/kg/h静脉组（P_2V组） ，CPB＋propofol 10mg/kg/h/静脉组（P_10V组 n=10）及CPB＋propofol 2mg/kg/h颈内动脉组（P_2a组），每组10只。体外循环开始后连接微量注射泵连续输注丙泊酚，直到CPB后1小时。CPB组给予同等容量的生理盐水。

3 标本制备及指标检测

3.1 循环功能监测  惠普多导生理记录仪监测大鼠MAP、HR等循环功能的变化。

3.2 海马CA1区神经元凋亡（TUNEL法） 

采用DNA原位末端标记法（terminal deoxynucleiotidyl transferase dUTP-bition nick end labeling, TUNEL）,凋亡试剂盒（In Situ Cell Death Detection Kit, POD），阳性染色为棕黄色。凋亡图像分析采用Axioplan 2 imaging 系统 (德国ZEISS公司)，Axiocam 数码相机分辨率 1200万（3900X3090）像素。根据阳性面积占整个测量面积百分比，计算出阳性率。

3.3 电镜检测

灌注温生理盐水200ml后灌注冰冷的4%多聚甲醛磷酸缓冲液400ml，取脑置入2.5%的戊二醛中保存，制作电镜标本检测超微结构的变化。

3.4海马 Bcl-2和Bax mRNA表达检测 

实验结束后即刻取海马组织标本行凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA的检测，内参照为β­-actin。用Tanon GIS gel imaging system测定PCR产物电泳密度。各基因mRNA表达强度以其PCR产物电泳密度值与看家基因β-actin比值来表示。

3.5海马区组织Bcl-2和Bax Weatern 印迹分析 <?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

实验结束后即刻取海马组织标本行凋亡相关基因产物的Western印迹分析，内参照为β­-actin。海马组织称重后加入组织裂解液匀浆,12000g4℃离心30min，取上清并加入等体积2×上样buffer混匀，煮沸5min，BCA法测定蛋白质浓度。每孔上样50μg,12.5%SDS-PAGE分离样品。于低温30V过夜将蛋白转至NC膜上，用封闭液(5%脱脂奶粉，3%BSA,0.02%Tween-20溶于PBS)室温封闭2ｈ，将膜与溶于封闭液中的一抗(兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体1∶200；小鼠抗大鼠Bax单克隆抗体1∶250)室温孵浴2ｈ，PBS洗5min×3次，TBS洗5min×3次，将膜与溶于二抗稀释液(5%脱脂奶粉，0.02%Tween-20，150mmol NaCl，150mmol Tris-Cl,pH7.5)中的二抗室温孵浴1ｈ，TBS洗5min×3次，将膜装入可热接封的塑料袋中，加入ECL试剂，暗室暴光，显影，定影，对Ｘ光底片拍照，永久保存。Western analysis 条带用ImagQuant FL Image analysis software 图像分析软件，计算灰度值，然后与β-actin灰度值相比行Normalization，作直方图比较。

4.统计分析

数据采用，组间比较One-way ANOVA方差分析，运用GLM过程，P<0.05认为差异有显著性。

结　果

1.CPB期间各组生理参数

　　各组大鼠生理指标基础值（baseline）差异无显著性。P_10V组的心率（HR）在CPB停机后明显增快，与CPB组和基础值相比差异有显著性（P<0.05）； P_2a组和P_2V组的HR变化不明显。CPB停机后，P_10V组的平均动脉压（MAP）明显降低，与CPB组和基础值相比差异有显著性（P<0.05）；P_2a组和P_2V组的MAP变化不明显。Hct、PaO₂、PaCO₂及pH的变化组间无明显差异[表1]。

2.海马CA1区神经元凋亡

TUNEL染色结果显示：CPB后海马CA1区神经元凋亡明显增强于Non-CPB组（P<0.05）。与CPB组相比，P_10V组和P_2a组海马CA1区神经元的损伤明显减轻（P<0.05），但仍高于Non-CPB组，P_10V组和P_2a组相比差异无显著性（P>0.05）。P_2V组与CPB组凋亡程度相似（P>0.05） [图1，2]。

凋亡是一种程序性细胞死亡，是神经元损伤重要方式之一。凋亡相关基因（bax, bcl-x 和 bad）启动凋亡过程，而其它基因（bcl-2, ced-9）则抑制凋亡，两者相互制衡^[12]。丙泊酚明显抑制缺血再灌注后海马CAI区锥体细胞凋亡,减少延迟性神经元死亡^[13]。丙泊酚对谷氨酸盐、同型半胱氨酸,buthionine sulfoximine,过氧化氢诱导的鼠脑皮质和海马区HT-2神经元凋亡亦有良好抑制作用^[14]。基于大鼠体外循环模型，我们既往的研究也表明体外循环可引起大鼠海马CA1区神经元凋亡，明显升高bax和bcl-2 mRNA表达，加重神经元病理损伤，且随着体外循环时间的延长而进一步加重损伤^[15]。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

本研究表明丙泊酚10mg．kg^-1．h^-1静脉给药明显抑制海马神经元凋亡，减轻神经元病理损伤，增加bcl-2蛋白表达, 抑制bax蛋白表达，但是对于循环系统抑制作用明显。而小剂量的丙泊酚静脉输注对神经元凋亡及bcl-2和bax mRNA表达却没有明显影响。同样剂量丙泊酚经颈内动脉输注却能够产生与大剂量丙泊酚静脉应用相似的保护作用，明显抑制神经元凋亡，减轻体外循环对中枢神经系统的病理损伤，并且对血压和心率的影响轻微，不产生循环抑制。

综上所述，小剂量丙泊酚颈内动脉连续输注，可通过抑制凋亡减轻体外循环下中枢神经系统的病理损伤而产生脑保护作用，同时避免了大剂量丙泊酚输注对循环系统的抑制作用，从而为丙泊酚动脉输注的药效学和丙泊酚的脑保护提供全新的尝试。

参考文献

1  Kahveci FS, Kahveci N, Alkan T et al.Propofol versus isoflurane anesthesia under hypothermic conditions: effects on intracranial pressure and local cerebral blood flow after diffuse traumatic brain injury in the rat.Surg Neurol，2001;56:206-14

2  金沐，孙来保，谭洁芳 et al.浅低温体外循环围术期丙泊酚的脑保护效应.中华麻醉学杂志,2003;23:587-91

3  Mackensen G，Burkhard MD. Cardiopulmonary Bypass Induces Neurologic and Neurocognitive Dysfunction in the Rat, Anesthesiology,2001;95:1485-91

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6  Murphy EJ. Intra-arterial injection of metoclopramide, midazolam, propofol and pethidine. Anaesth Intensive Care,2002;30:367?9
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9 秦晓辉,米卫东,张宏,et al. 异丙酚对神经元缺氧损伤的保护及其作用机制. 中国药理学通报,2003; 19:1024-72

10张树平,王建波,王巧云,et al.不用剂量异丙酚对大鼠血流动力学的影响.中国药理学通报，1996；12:191-2

11 Wang M, Joshi S, Emerson RG. Comparison of Intracarotid and Intravenous Propofol for Electrocerebral Silence in Rabbits. Anesthesiology, 2003;99:904-10

12  ZHOU Haiyan,MA Yuefeng,ZHOU Feng et al.Effects of magnesium sulfate on neuron apoptosis and expression of caspase-3,bax and bcl-2 after cerebral ischemia-reperfusion injury .Chinese Medical Journal,2003;116:1532-4

13  Kodaka M, Mori T, Tanaka K et al. Depressive effects of propofol on apoptotic injury and delayed neuronal death after forebrain ischemia in the rat--comparison with nitrous oxide-oxygen-isoflurane.Masui,2000;49:130-8

14  Sagara Y, Hendler S, Khoh-Reiter S et al. Propofol hemisuccinate protects neuronal cells from oxidative injury.J Neurochem,1999;73:2524-30

15  张挺杰,杭燕南. 体外循环对大鼠海马CA1区神经元凋亡的影响.中华麻醉学杂志，2004;24:20-4