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急性肺损伤大鼠血管内皮细胞损伤的研究
时间：2010-08-24 11:38:54 来源： 作者：
| 1资料与方法 1.1研究对象 健康Wistar大鼠60只（中国医科大学实验动物部提供），雌雄各半，体重240±30g。实验条件下饲养一周，随机分为实验组和对照组，每组各30只。氯胺酮0.2～0.3 mL，腹腔注射麻醉动物，仰卧位固定于鼠台上，颈部消毒，正中切口，逐层分离，暴露气管。气管内注入博莱霉素溶液（天津太河制药公司，批号：970802）0.3～0.5 mL（0.5 mg/100g大鼠），对照组注入同剂量的生理盐水。旋转动物，使药液在肺内分布均匀，局部消毒，缝合，饲养。两组动物分别于气管内灌注后第12小时、1、3、7、14、28天随机处死5只大鼠。 1.2 标本采集 麻醉动物后，左颈动脉采肝素抗凝血0.2mL查血气分析。开胸，心肺暴露，右心室采血处死动物，取血4.5mL与0.5mL 3.8%枸橼酸钠溶液充分混合后立即分离CEC，另取血1mL加40u 110% EDTA抗凝，分离血浆，冻存，待测MDA。分离气管，钳夹左肺门。用无菌PBS对右肺进行支气管肺泡灌洗（BAL）4mL×10次，回收灌洗液，平均回收率为(91.2±2.0)%。切除左肺，经左主支气管向肺内注入4%多聚甲醛，使胸膜展开后置于10%福尔马林中固定。常规制成厚为5μm的石蜡切片。HE染色。 1.3 CEC的分离、计数及鉴定 (1) 分离CEC：采用Hladovec[3]建立的从富含血小板的血浆中分离CEC的方法。分五步进行：①将采集的4.5 mL抗凝血标本以395g离心20min（LXJ-II型离心机 上海医用分析仪器厂），收集全部上清液；②将0.1%二磷酸腺苷（ADP）液0.2 mL加入上清中，并置于MVS-1漩涡混合器（北京北德科学仪器有限公司）中振荡10min；③将②液离心20min（395g）；④将由③所得的上清以2 100g离心20min，其沉淀物便是欲获得的CEC；⑤将0.1 mL生理盐水加入离心管中，振荡10min，使沉淀物重悬后备检CEC。(2) CEC计数：取上述悬液少许滴于Neubaer血细胞计数板内，在olympus相差显微镜下计数，二人分别计数，共计4次，取其均值作为CEC数，单位：n/0.9μL（每次计数9个大方格，体积为0.9μL）。(3) 鉴定 将分离的CEC用2.5%戊二醛固定，1%鹅酸后固定。常规丙醛脱水、Epon-812包埋、超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，JEOL-1200EX型透射电镜观察内皮细胞特异的W-P(Weital-Palade)小体，鉴定CEC。 1.4 肺泡灌洗液的总分数 上述灌洗液经双层纱布过滤后在Neubaer计数台上计数BALF的细胞总数，单位为n×106/mL。肺泡灌洗液以395g离心10min，去上清，用PBS调细胞数为5×106/mL，取50 μL滴于玻片上，沉淀20min，滤纸吸去上清，自然干燥后95%酒精固定，HE染色，Olympas显微镜下计数各种炎性细胞百分比。 1.5 MDA测定：采用TBA比色法，以四氧基乙基甲烷（TEP）为标准品，用722分光光度计测定535nm处吸光度，与标准品比较，单位为nmol/mL。 1.6 血气分析：取肝素抗凝动脉血0.5mL于AVL-990血气自动分析仪上测定动脉血氧分压，单位为mmHg。 1.7 统计学处理：数据采用x±s表示，进行计量资料t检验。直线相关回归分析。P < 0.05表示差异有显著性。 2 结果 2.1 体重 BLM组大鼠体重为(240.67±24.00)g，对照组体重为(237.17±25.89)g，二者的差值无显著性意义。对照组体重无明显下降，BLM组3天时体重平均下降约16%，14天以后逐渐恢复正常。 2.2 病理组织学所见 对照组各组无差异，肺泡腔偶见炎性细胞渗出，肺泡间隔无增厚。BLM组第1天镜下见肺泡腔少量渗出，肺泡间隔无增厚。第3天肺泡腔渗出明显增加，以巨噬细胞及嗜中性粒细胞为主。第7天细胞渗出达高峰，并见斑块样肺实变，正常肺泡结构消失，肺结构紊乱。第14天见肺泡壁明显水肿，间质成纤维细胞增殖、胶原沉积，肺泡腔内炎症细胞减少。第28天形成局灶性的纤维化。 2.3 CEC的形态学观察及动态变化 2.3.1 形态学观察 CEC形态多样，多为极不规则的多边形，体积较大。绝大多数细胞无细胞核，呈皱缩、折叠或扭曲状，电镜观察见细胞明显变形，呈不规则形状，胞质中可见多个空泡形成，少数细胞可见细胞核，并于核周围可见内皮细胞特有的W-P(Weital-Palade)小体。 2.3.2 CEC的动态变化 对照组CEC数无明显变化，BLM组的CEC用药1d后即开始升高，第3天达到高峰，持续至第7天，14d后逐渐恢复正常，见表1。 表1 CEC动态变化
注：1）t检验，P < 0.01 2.4 肺泡灌洗液中炎症细胞总分数 BLM组第1天BALF中细胞总数即开始增加，第3天达高峰，持续至第7天，14d后逐渐恢复正常；中性粒细胞在第1天明显增加，第3天达高峰，14d后降至正常；淋巴细胞在第7天达高峰。与对照组相比差异具有显著性，P < 0.01见表2。BALF总数及中性粒细胞的高峰出现时间都与CEC相一致。 表2 BALF中炎症细胞的总分数的变化
注：1）t 检验，P < 0.05；2）P < 0.01 2.2 动脉血氧分压 BLM组大鼠动脉血氧分压在第14天及第28天略有下降，但与对照组的差异无统计学意义，P > 0.05，见表3。 表3 BLM大鼠动脉血氧分压变化
2.3 MDA的动态变化 MDA在支气管灌洗BLM 12h后即明显升高，早于CEC升高，第7天达高峰，以后逐渐下降，见表4。 表4 BLM大鼠血中MDA动态变化
注：1）t 检验，P < 0.05；2）P < 0.01 3讨论 血管内皮细胞（Vascular Endothelial cells, VEC）是覆盖于血管内侧面的单层扁平上皮细胞，除对各种大分子物质和血细胞成分进入周围组织起选择性通透屏障作用外，还具有重要的内分泌功能，在调节血管舒缩状态及通透性、对抗血小板聚集、维持血管壁完整性方面均具有重要的意义。正常情况下VEC能合成前列环素（PGI2），PGI2与血小板产生的血栓素（TXA2）保持动态平衡，以对抗血小板聚集及血栓形成。VEC还合成组织型纤溶酶原激活物（tPA）及其抑制物（PAI），共同调节纤溶过程[4]。另外VEC产生的内皮素（endothelin ET）、TXA2、血管紧张素II等缩血管物质与其产生的一氧化氮（NO）、PGI2等舒血管物质之间的平衡状态调节血管的舒张和收缩。 循环内皮细胞（circulating endothelial cells, CEC）是指生理或病理状态下从循环血中获得的VEC，正常VEC的平均寿命大约为3个月，每天都有许多VEC衰老、脱落成为CEC。1970年Caynor[5]首次从兔外周血中发现了源于内皮细胞的细胞，并使用了CEC这一术语。经过国内外学者近30年的研究，分离、记数、鉴定CEC的方法已臻于成熟[2、5]。现在认为，人和动物在生理状态下存在一定数量的CEC反映了VEC的自然更替，而在许多病理状态下CEC的增加则反映VEC的受损情况。CEC是在活体仅有的作为VEC损伤的特异而直接的指示物[6]。在吸烟、乏氧、枪击伤、冠状动脉粥样硬化性心脏病、持续血糖升高或伴有微血管病变的糖尿病、斑疹伤寒等多种危险因素的激惹下，都可造成VEC的损伤，导致内皮细胞脱落[4,7-10]。若刺激作用于局部，则损伤主要发生于最接近应激部位的毛细血管床，而且脱落内皮细胞数量的多少与血管壁受损的程度相关[9]。肝素、阿司匹林、整合素及抗坏血酸、维生素E、谷胱甘肽等低分子的活性氧基清除剂对血管内皮细胞均有较好的保护作用，使内皮细胞脱落减少[7,11]。 本实验采用博莱霉素（BLM）致大鼠急性肺损伤模型，通过分离记数血中CEC的动态变化来反映活体状态下VEC的受损程度，结果表明在肺损伤早期， CEC明显高于对照组，CEC在第1天开始升高，第3天达到高峰，以后逐渐下降。Phan等观察到VEC是博莱霉素引起的急性肺损伤的最初靶细胞之一，而且这一损伤可通过使TGF-ß等细胞因子合成及释放增加而启动一逐级放大的生化反应。Hoyt通过VEC的体外培养进一步证明：BLM可引起内皮细胞DNA 3’-OH端断裂，早期去除BLM或加入整合素，则内皮细胞的损伤是可逆的。本实验同时测定了血中丙二醛（MDA），结果显示，MDA在气管内灌注BLM后12h即开始升高，7d达高峰，14d后降至正常，且与CEC呈显著正相关，提示血管内皮细胞受损可能与脂质过氧化反应有关。 炎性细胞穿过血管向肺泡腔及间质的移行和浸润是肺泡炎的重要环节。本实验观察到BALF中细胞总数及中性粒细胞在第1天开始升高，第3天达高峰，14d以后逐渐恢复正常，高峰出现时间与CEC的高峰出现时间相一致，经检验二者呈正相关，提示炎症细胞（特别是中性粒细胞）在肺泡腔的积聚可能与VEC损伤有关。炎症细胞浸润这一过程的关键步骤是白细胞与VEC表面的粘附[12]。白细胞上的粘附分子与VEC上存在的粘附分子的配体（CAMs）之间的相互作用可使粒细胞粘附于内皮细胞表面，从而穿过内皮细胞层到达炎症病变区域。 总之，通过本研究发现BLM致大鼠急性肺损伤过程中存在肺血管内皮细胞的损伤。VEC损伤可能与活性氧基引起的脂质过氧化反应有关。而且，VEC的损伤与肺泡灌洗液中的炎性细胞（特别是中性粒细胞）有明显的相关性，推测VEC损伤在炎性细胞聚集及肺损伤进程中可能发挥重要作用。应用氧自由基清除剂及VEC保护剂渴望在抑制及调节炎症细胞浸润及在肺泡腔的积聚、防止肺单位的进一步损伤等方面发挥作用。许多细胞具有相互交叉的生物学特性，同一病理过程又有多种细胞共同参与。血管内皮细胞与其他炎症细胞在致肺损伤过程中的关系还有待于进一步的深入研究。 参 考 文 献 [1] Crystal RG，Bitterman PB，Renneral SI，et al. Interstitial lung diseases of unknown cause：Disorders characterized by chronic inflammation of the lower respiratory tract [J] . N Engl J Med, 1984, 310(3): 154-166. [2] Iwata Y，Kuzuya F，Hayakawa M，et al. Circulating endothelial cells fails to induce cerebral infarction in rabbits [J]. Stroke, 1986, 17(5): 506-509. [3] Hladovec J，Rossmann P. Circulating endothelial cells isolated together with platelets and the experimental modification of their counts in rats [J]. Thrombosis Res, 1973, 3(6): 665-674. [4] 杨丽霞，祝善俊. 内皮细胞损伤在冠心病患者中的发病学意义[J]. 中华内科杂志, 1993, 32(12): 816-818. [5] Caynor E，Bouvier C，Spaet JH，et al. Vascular Lesions：Possible Pathogenetic Basis of the Generalized Shwartzman Reaction[J]. Science, 1970, 170(11): 986-988. [6] Takahashi H and Harker LA. Measurement of human endothelial cells in whole blood[J]. Thrombosis Res, 1983, 31(1): 1-12. [7] Davis JW，Shelton L，Eigenberg DA，et al. Lake of effect of aspirin on cigarette smoke-induced increase in circulating endothelial cells[J]. Haemostasis, 1987, 17(1-2): 66-69. [8] 陈小容，邹霞英，辛达临，等. 循环内皮细胞检测在缺氧肺血管内皮细胞损伤中的意义[J]. 中华结核和呼吸杂志, 1996, 19(2): 78-80. [9] Liu LS, Wang YQ, et al. Injury to vascular endothelial cells and the change of plasma endothelin level in dogs with gunshot wound[J]. J Trau Inju Infe Criti Care, 1996, 400(3): 60-62. [10] George F，Brouqui P，Boffa MC，et al. Demonstration of Rickettsia conorii-induced endothelial injury in vivo by measuring circulating endothelial cells，thrombomodulin and Von Willebrand factor in patients with Mediterranean spotted fever[J]. Blood, 1993, 82(7): 2109-2116 [11] Hladovec J, Kornalik F. Heparin sulfate as a venostatic endothelial stabilizing factor[J]. Thrombosis Res, 1992, 68(6): 459-465 [12] Harlan JM. Leukocyte – endothelial interactions. Blood, 1985, 65(3): 513-525 |
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