您当前的位置：首页 > 主题内容 > 临床麻醉 > 基础与临床研究
单肺通气时IL-6 、IL-8、TNF-αmRNA基因表达和乌司他丁的影响
时间：2010-08-24 11:39:08 来源： 作者：
| AIM: To investigate the effects of ulinastatin on gene expression of IL-6、IL-8 and TNF-αmRNA during one lung ventilation. METHODS: Thirty patients with lung cancer ⅢA after chemotherapy ASA Ⅱ～ Ⅲ, for selective pulmonary surgery, were selected and were randomly divided into two groups: controlled group (group C, n = 15) and ulinastatin group (group U, n=15). Group U: Patients received ulinastatin 10000U.kg-1 iv after induction of anesthesia. Group C : Patients received equal volume of normal saline, instead of ulinastatin. The lung tissue which is far from the tumor was taken and washed two times by PBS. Total RNA was extracted from the lung tissue using a standard TRIzol protocol and expression of IL-6、IL-8 and TNF-αmRNA was detected by RT-PCR . RESULTS: The expression of IL-6、IL-8 and TNF-a mRNA in two groups were low after induction of anesthesia. They increased significantly 90min after one lung ventilation in two groups. Compared with controlled group, The expression of gene for IL-6、IL-8 and TNF-a mRNA in the ulinastatin group decreased significantly 90min after one lung ventilation .CONCLUSION: The expression of IL-6、IL-8 and TNF-a mRNA during one lung ventilation increased significantly, and ulinastatin could depress the expression of genes for these cytokines at the transcriptional levels and reduce lung injury. [KEY WORDS] Trypsin inhibitors; Pulmonary ventilation; Lung; Cytokines 手术麻醉、低氧和机械通气均可诱发肺的炎性反应，炎性细胞因子可能是最重要的因素[1]。低氧可致弥漫性血管收缩，使肺血管阻力增高，形成肺动脉高压，并可通过产生大量的超氧阴离子、ICAM-1及一些细胞因子产生急性肺损伤[2]。化疗后患者单肺通气围术期时血浆细胞因子明显增加[3]，但单肺通气时低氧引起的炎性细胞因子的表达还不十分清楚。因此，本研究应用RT-PCR技术观察化疗后病人单肺通气时非通气侧肺组织炎性细胞因子的表达情况，探讨单肺通气低氧肺损伤的可能机制并观察乌司他丁的干预影响。 资料与方法 1 一般资料 ⅢA期非小细胞肺癌患者30例，健择或泰素帝联合卡铂2周期化疗后手术，术前ASA评分Ⅱ~Ⅲ级。将入选患者随机分成对照组（C组，n=15）和乌司他丁组（U组，n=15）。所有患者均不包括：慢性阻塞性肺疾病，肺与胸壁发育不良，体重高于或低于标准体重30%以上，肾或肝功能不全，血球压积低于24%,术前有呼吸道炎症，肺功能检查FEV1/FVC〈70%者。 麻醉方法 术前用药：所有病人均于术前30min常规肌注哌替啶70mg、海俄辛0.3mg或阿托品0.5mg，入室后用Datex-Ohmeda AS/3多功能心电监护仪监测无创和有创血压、心电图（ECG）、脉搏氧饱和度（SpO2 ）、呼气末CO2 分压（PETCO2，mmHg)、气道压力（Paw）、麻醉气体浓度和氧浓度等。麻醉诱导:两组均用咪唑安定0.05mg/kg、异丙酚0.5~1.0mg/kg、芬太尼4μg/kg、维库溴铵0.1mg/kg诱导后，插入双腔气管导管，用OLYMPUS BF-3C40型光纤支气管镜确保导管到位。桡动脉穿插置管测压和采动脉血进行血气分析，并做中心静 脉穿刺。术中吸入异氟醚(1MAC以下)，并给予持续输入异丙酚4~6mg/kg/h和维库溴铵（0.06~0.08）mg/kg维持麻醉。U组 ：乌司他丁10000 U•kg-1用生理盐水稀释到20ml在麻醉诱导后缓慢注入，C组给予等量生理盐水代替。 2 通气方式 两组在单肺通气前均采用Datex-Ohmeda Aestiva 3000麻醉机或Fabrus2000麻醉机控制呼吸，吸入纯氧。开胸后既行单肺通气，单肺通气时潮气量9ml/kg,频率10~16次/min，PETCO2 （4.67~6.0）kPa [(35~45)mmHg]，Paw<40mmHg。两组在单肺麻醉期间非通气侧肺的支气管导管直接开口于大气中。 3样品的采集及处理 在开胸后（T1）和单肺通气90min后（T2）取远离肿瘤的肺组织各一块，PBS冲洗两遍，用无RNA酶（Rnase）的剪刀剪成1cm3，分别装人 1.5ml无Rnase 的离心管中，液氮速冻后保存于-80oC超低温冰箱备用。 主要的试验仪器和试剂 仪器：电动匀浆器，旋涡混合器，离心机，日本岛津紫外分光光度计，HG370水平电泳系统，数码凝胶成像分析仪，全自动PCR 扩增仪，全自动离心浓缩真空干燥仪。试剂：焦碳酸二乙酯（DEPC），总RNA提取试剂（TRIZOL），RT-PCR试剂盒，均为美国Invitrogen公司产品；氯仿，中国医药集团上海化学试剂公司 ；溴酚蓝，AMRECO分装；10mg/ml溴化乙锭（EB）: 在100ml DEPC水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌至完全溶解，然后转移到用铝箔包裹的棕色瓶中，室温保存；Tag试剂盒；PBS 溶液： 在800ml dd H20 中溶解8g NaCL,1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl调节溶液的pH至7.4,加水定容至1000ml, 高压灭菌20min, 室温保存。IL-6引物sense:CTGTTGTTGCTGTGGCTGATantisence: TCCGTCCACAAGCAATGAGT,扩增片段长度为472个碱基。IL-8引sense:ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT,antisence:TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC，扩增片段长度为289个碱基。TNF-a引物sense: TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC ，antisence: CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC 扩增片段长度为295个碱基。β-actin引物sense:TTGTAACCAACTGGGACGATATGG antisence: GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG扩增片段长度为348个碱基。 RT-PCR（1）RNA提取 采用TRIZOl试剂一步提取法提取RNA，参照试剂盒说明书操作。提取的RNA经紫外分光光度计测定A260/A280比值在1.8-2.0之间并进行定量。提示所提总RNA完整、纯度高。（2）cDNA第一链的合成在0.2ml PCR管中分别加入RNA 19μl，oligo（dT）20 1μl，置 PCR扩增仪上65oC 5min，后依次加入5×cDNA buffer 8μl，0.1M DTT 2μl，10mmol dNTP mix 2μl，RNA inhibitor 0.5μl，ThermoScript 0.5μl，DEPC水7μl，加水至总体积为40μl。置 PCR扩增仪上55℃ 60min,85℃ 5min;加0.5μl RNA酶37℃ 30min。产物cRNA置-80℃保存备用。（3）PCR PCR反应体系总体积为20μl。CDNA 2μl，10×PCA buffer 2μl，MgCl2 (25mM)1.6μl，dNTP(10mM) 0.4μl，Primer Mix (5μM)1μl，Taq 酶0.2μl，加水12.8μl。（4）扩增条件：β-actin为94℃预变性6min，然后94℃变性50s、60℃退火50s、72℃延伸1min，总共35个循环，最后72℃延伸7min；IL-6、IL-8、TNF-a为94℃预变性7min，然后94℃变性50s、60℃退火50s、72℃延伸，总共35个循环，最后72℃延伸7min;PCR产物置4℃备用。（5）PCR产物测定 PCR扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳后，数码凝胶成像分析仪照相，Molecular Analyst软件进行吸光度溶积分析，计算IL-6、IL-8、TNF-α/β-actin 灰度的比值进行半定量分析。 4统计学处理 应用SPSS 11.0软件进行统计学分析。结果用均数±标准差（ ±s）表示。采用重复测量的资料方差分析，两组之间均数的比较采用两独立样本的t检验。 Table 1 Effects of Ulinastatin on the expression of IL-6 mRNA（—X ±s,n=15）
2 化疗后单肺通气 IL-8 mRNA的表达及乌司他丁对它的影响 表2 乌司他丁对IL-8基因表达的影响
3 化疗后单肺通气 TNF-αmRNA表达及乌司他丁对 它的影响 Table 3 Effects of ulinastatin on the expression of gene for TNF-αmRNA（_X ±s,n=15）
讨 论
TNF-α主要由激活的巨噬细胞产生，其主要生物活性是导致肿瘤细胞坏死，同时也具有抗感染和免疫调节作用。是炎症早期最具影响的介质之一，它导致肺损伤的机制为介导白细胞、血小板激活和内皮损伤，促进粒细胞在肺毛细血管内聚集、激活，释放溶酶体酶、自由基和脂质代谢产物等炎性介质和诱导产生IL-1、IL-6等其他炎性因子[9]。在机械通气中，Takata[10]等报道，传统的通气模式肺组织中的TNF-α的表达明显高于高频通气时的TNF-a的表达。我们的结果也表明，单肺通气90min后 TNF-α的表达均明显增强，显示手术麻醉和单肺通气均能导致肺的炎性反应，乌司他丁能减轻这种反应。 IL-8是效能最强的中性粒细胞趋化因子之一，毒性物质或伤害性刺激均导致肺泡巨噬细胞IL-8和其他炎性因子的表达[11]。我们观察到两组病人单肺通气90min后IL-8的表达均明显增强，这也和血清中的IL-8浓度增高相一致[3]，乌司他丁组的IL-8的表达明显降低，表明乌司他丁能在转录水平抑制IL-8的表达，减轻肺损伤。 细胞炎性因子的刺激对ICAM-1表达取到重要的作用。在TNF-α、TNF-r、IL-1等细胞因子刺激下，肺微血管内皮细胞ICAM-1表达增强[1 0,12]。陈学均[13] 也报道，在动物实验中，机械通气后，血清和肺组织匀浆TNF-α升高，诱发血管内皮细胞表面ICAM-1表达增强，导致肺组织中中性粒细胞的大量聚集，从而引起或加重肺组织损伤，这在其他研究中也得到证实[14]。体外实验证明，低氧应激和继后的再氧合可导致大量释放IL-6, IL-6可诱导ICAM-1的合成。IL-6 刺激下ICAM-1 mRNA的表达增加，依赖于ICAM-1的中性粒细胞-内皮细胞黏附也增加，这种增加可被人抗IL-6单克隆抗体抑制。 本实验结果证明，单肺通气90min后肺组织中的IL-6、IL-8达明显增强，且TNF-α的表达也均相应明显增强，乌司他丁可明显降低细胞因子的表达。 乌司他丁的这一作用可能与其有抑制多形核中性粒细胞酶的活性，减少氧自由基的产生（氧自由基的增加可直接诱导IL-8的转录、复制，促进IL-8等细胞因子的释放），清除内毒素，抑制炎性介质的生存和释放有关，由此达到抑制黏附因子的表达，减轻肺损伤的作用。 [参 考 文 献] [1] Slutsky AS,Tremblay LN. Multiple system organ failure. Is mechanical ventilation a contributing factor? [J].Am J Respir Crit Care Med, 1998,157(6 Pt 1):1721-1725. [2] 丁学琴，刘贵明，王俊科，等. 吸入一氧化碳对急性缺氧性肺动脉高压及缺氧性肺损伤的影响[J].中华麻醉学杂志，2003,23(5):361-364. [3] 马武华，吴一龙，李朝霞，等.乌司他丁对化疗后病人单肺通气时炎性因子的影响[J].中山大学学报（医学科学版），2005，26（1）：81~84 [4] Rimensberger PC ，Fedorko L,Cutz E, et al.Attenuation of ventilator-induced acute lung injury in an animal model by inhibition of neutrophil adhesion by leumedins (NPC 15669) [J].Crit Care Med, 1998 ,26(3):548-55. [5] Dumoulin FL，Nischalke HD,Leifeld L,et al.Semi-quantification of human C-C chemokine mRNAs with reverse transcription/real-time PCR using multi-specific standards[J].J Immunol Methods, 2000,241(1-2):109-119. [6] 马武华，高婉菱，吴一龙，等.氧化亚氮在单肺通气时对肺内氧合和动脉血乳酸水平的影响[J].中国病理生理杂志，2004，20（11）：2037~2039. [7] Albelda SM ，Smith CW, Ward PA.Adhesion molecules and inflammatory injury[J]. FASEB J, 1994,8(8):504-512. [8] Sanders KA, Huecksteadt T, Xu P,et al. Regulation of oxidant production in acute lung injury[J].Chest,1999,116(1suppl):56S-61S. [9] Shapiro L,Gelfand JA. Cytokines and sepsis: pathophysiology and therapy[J].New Horiz, 1993,1(1):13-22. [10] Takata M, Abe J, Tanzka H, et al. Intraalveolar expression of tumor necrosis factor-alpha gene during conventional and high-frequency ventilation[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1997,156:272-279. [11] Fingar VH, Taber SW,Johnston MN, et al.Constitutive and stimulated expression of ICAM-1 protein on pulmonary endothelial cells in vivo[J].Microvasc Res, 1997,54(2):135-144. [12] 郭禹标，李志平，谢灿茂，等.巨噬细胞浸润和细胞间粘附分子-1在油酸致大鼠急性肺损伤发病中的作用[J]. 中国病理生理杂志，2001，17（9）：898~900. [13] 陈学均，文亮，尹昌林,等. 细胞间粘附分子-1在机械通气致肺损伤中的作用[J].中华麻醉学杂志，2000，20（9）：552-555. [14] 李风雷，刘晓晴，柳青，等. 鱼腥草对油酸性急性肺损伤大鼠肺组织TNF-a表达的影响[J]. 中国病理生理杂志，2003，19（4）：547~548. |
|
|
[!--temp.pl--]