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静脉复合胸段硬膜外阻滞对兔心肌梗死后c-fos和HSP70基因表达的影响
时间：2010-08-24 11:39:47 来源： 作者：
| 对心肌缺血再灌注引起的应激，在分子生物学水平上已有一些研究，其中c-fos和热休克蛋白（Heat Shock Protein HSP）70基因的表达研究较多。c-fos基因为原癌基因中的即早基因，心肌局部缺血时，它能快速即早表达，可能参与心肌缺血再灌注损伤1。HSP70是一种分子伴侣，存在于正常细胞内，对稳定细胞结构起重要的作用。机体细胞受到热休克或其他应激原作用后，HSP70基因的表达增加明显。本文用兔机械性心肌梗死动物模型，探讨气管插管全麻复合胸段硬膜外阻滞（TEA），对心肌梗死后非梗死心肌内c-fos和HSP70基因mRNA表达的影响，进一步研究全麻复合TEA对应激水平的影响。 材料与方法 研究对象 28只健康新西兰大白兔，雌性16只，雄性12只，体重2.5~3.8kg。随机分成两组，每组各14只。 麻醉和监测 用1%戊巴比妥钠给兔静脉麻醉，输乳酸林格氏液40 ml及血定安20ml。气管切开插管，保留自主呼吸；硬膜外置管用切开法，使导管达T2~3；向硬膜外腔注入2%利多卡因。经左颈总动脉直接测平均动脉血压 （MAP），接心电图机，以注麻醉药后MAP迅速下降为硬膜外阻滞有效的标准，确定实验组硬膜外阻滞有效后，开胸结扎左冠状动脉前降支，观察心电图变化确认心肌梗死的存在。对照组不做TEA，其余处理与实验组相同[2] 。 标本的采集和抽提总RNA 于结扎4h后处死动物，取非梗死区域心肌一块， 置液氮中保存。取心肌组织100毫克，在5ml匀浆器中用Trizol-异丙醇-氯仿法抽提总RNA；用1%琼脂糖甲醛变性胶在1×MOPS中电泳，确认未降解，再用紫外分光光度计测总RNA的OD值、比率和浓度。 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 取0.7μg总RNA，用一步法RT-PCR 试剂盒（Promaga）研究c-fos和HSP70相对于内参基因β-actin的表达。所用引物c-fos为：5’-ACCAGCCCAGACCTGCAGTGG-3’（上游引物）和5’-CCGGCACTTGGCTGCAGCCAT-3’（下游引物），片段长度为261bp3；HSP70为5’-CTCCAGCATCCGACAAGAAGC-3’(上游引物)和5’-ACGGTGTTGTGGGGGTTCAGG-3’(下游引物),片段长度为234bp；β-actin为5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(上游引物)和5’-CATCGGAACCGCTCGTTGCCAATAG-3’(下游引物)，片段长度为293bp4。反应条件按说明书，共35个循环。 PCR产物分析 取10μl反应产物，加6×DNA上样缓冲液2μl充分混合后上样，加入1×TAE缓冲液中的1%琼脂糖溴化乙锭凝胶上样孔中，用基因公司100bp的DNALadder做基因尺。于100V下电泳，当溴酚蓝至胶长的1/2处时，于紫外灯下观察，根据基因尺确定扩增产物条带为目的条带，图象分析仪拍照分析曲线下面积，分别计算PCR产物的密度及相对于β-actin的值。 统计学分析 用t检验分别比较两组的PCR产物密度c-fos/β-actin和HSP70/β-actin，P<0.05认为有显著性差异。 结 果 实验组和对照组分别有7例和6例通过了整个实验和RT-PCR研究。两组非梗死心肌c-fos、HSP70、β-actin基因mRNA的RT-PCR产物电泳后，密度扫描分析及相对于β-actin的值见表1。实验组c-fos/β-actin和HSP70/β-actin的值与对照组比较，经t检验，P<0.001，实验组明显低于对照组。 讨 论 心肌梗死是一种强烈的应激原，作用后将会启动或加快应激因子基因的表达，使细胞内的mRNA的含量增加，此为转录，特异的mRNA将翻译为特定的应激因子蛋白质。用分子生物学方法检测特定的mRNA的量，常被用来研究特异性蛋白质的表达。β-actin为细胞内表达稳定的基因，将其作为内标，可校正加样误差。RT-PCR就是将细胞内的总mRNA提取出来，用特异性引物在逆转录酶的作用下，成为cDNA，再用特异性引物将其扩增，用β-actin 校正，以确定mRNA的含量。 热应激、乙醇、重金属离子、氨基酸类似物、过氧化氢或自由基、缺血、冷损伤、感染、低氧血症等多种应激原可诱导HSP的产生，对细胞受到的应激性损伤起重要的保护作用。Das等[5]大鼠的心肌缺血再灌注预处理后，观察到心肌内HSP等与应激相关基因和抗氧化基因的表达增加，使心肌对抗缺血性损伤能力增加。Mehta等[6]常温下结扎兔冠状动脉前降支，发现18分钟内有HSP70mRNA 的表达。Knowlton等[7]在兔心肌缺血再灌注的研究中发现，再灌注区域的HSP70mRNA 于1h后升高，4h 达到顶点，24h后恢复到基础水平。本实验中实验组中的HSP70的表达，相对于表达稳定的内参基因，明显低于对照组。 c-fos基因表达的产物Fos蛋白与c-jun基因表达的产物Jun蛋白结合，作用于DNA，调节相关基因的转录，发挥第三信使的作用[8]，是心血管系统生长发育和应激所必须的基因[9]。本实验结果显示，实验组c-fos与β-actin比值的均数，低于对照组，说明实验组动物非梗死心肌内c-fos基因的的表达要比对照组低。 本实验将兔心肌梗死作为应激原，通过研究HSP70和c-fos基因的表达，说明全麻复合TEA相对于单纯全麻可降低应激引起的HSP70和c-fos基因的表达，降低应激水平。十多年前临床上就有用TEA治疗心绞痛和心肌梗死的报告，本研究结果从应激反应的角度，为其提供了又一实验依据。同时也可为临床上心肌缺血患者的麻醉选择提供一定的帮助。 参考文献 1 Brand T, Sharma HS, Fleischmann KE, et al. Proto-Expression in porcine myocardium subjected to ischemia and reperfusion. Circulation Res, 1992,71:1351-1360 2 陈志扬，薛张纲，蒋豪. 全麻复合胸段硬膜外阻滞对兔实验性心肌梗死的影响. 中华麻醉学杂志，2000，20：618-620 3 Osbaldeston NJ, Lee DM, Cox VM, et al. The temporal and cellular expression of c-fos and c-jun in mechanically stimulated rabbit latissimus dorsi muscle. Biochem J, 1995,308:465-471 4 Zhao Y, Wein AJ, Levin RM. Assessment of stress gene mRNAs(HSP-27, 60 AND 70) in obstructed rabbit urinary bladder using a semi-quantitative RT-PCR method. Mol cell Biochem, 1995,148:1-7 5 Das DK, Engelman RM, Kimura Y. Molecular adaptation of cellar defences following preconditioning of the heart by repeated ischemia. Cardiovasc Res, 1993,27:578-584 6 Mehta HB, Popovich BK, Dillmann WH. Ischemia induces changes in the level of mRNAs coding for stress protein 71 and creatine kinase M. Circ Res, 1988,63:512-517 7 Knowlton AA, Brecher P, Apstein CS. Rapid expression of heat shock protein in the rabbit after brief cardiac ischemia. J Clin Invest, 1991,87:139-147 8 Morgan JI, Curran T. Stimulus transcription coupling in the nervous system:involvment of the inducible proto-oncogenes fos and jun. Ann Rve Neurosci, 1991,14:421-451 9 Simpson PC. Proto-oncogenes and cardiac hypertrophy. Ann Rev Physiol, 1988,51:189-194 表1 两组非梗死心肌c-fos、HSP70、β-actin基因mRNA的RT-PCR产物密度
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