【关键词】蛛网膜下腔；小鼠；PE一10

Wu等于2004年发明了小鼠蛛网膜下腔长期置管技术【1】，对小鼠特别是基因改造小鼠在脊髓药理学，毒理学及疼痛研究中的应用提供了重要的技术支持。该方法是在小鼠腰5／6椎间隙，将拉长的聚乙烯管(PE10)与引导钨丝穿过脊柱周围组织及硬膜，置入蛛网膜下腔， 直至导管顶端到达腰膨大。本文在此方法基础上进行了改进和简化，并观察两者的导管泄露、术中死亡、直观失败、术后运动功能障碍、脊髓损伤、利多卡因试验阳性率、导管回缩／拔出、亚甲蓝定位导管位置等情况，以及两组小鼠术后十天的运动协调功能和吗啡鞘内注射的镇痛作用。

1 材料与方法

1．1 实验动物分组及材料

50只雄性C57BL／6J小鼠，8-10周龄，23-28 g，由中南大学实验动物中心提供[SCXK(湘)2006．0002]，随机 为Wu方法组(n=30)和改良方法组(n=20)。转轮跑步机(Ugo Basile，Comerio，Italy)，光热鼠尾测痛仪(33型，IITC Inc．，Woodland Hills，CA)， PE10导管f内径0．30 mm，外径0．60 mm，国产)，25 ul微量注射器(国产)，盐酸吗啡注射液(青海制药厂)。

1．2 方法

1．2．1 导管制备导管使用外径为0．6 mm的PE10管制备，每段长11cm，一端缓慢拉伸至外径为0．3mm左右(游标卡尺测量)，导管死腔容积约为5 ul。Wu方法组：拉伸后的导管穿入直径为0．12 mm引导钨丝防止压闭管腔，在距导管细端2cm和粗端2.5 cm处用火焰快速加热导管后轻轻压迫导管，形成两个扁平小球用于固定。抽出引导钨丝，注入生理盐水，选取没有泄露的导管用于实验。改良方法组：以小段parafilm封口膜缠绕导管做成3个小球用于固定和定位。第1个小球距导管细端1．8-1．9 cm(用于20 g左右小鼠)或2．0～2．1 cm(用于30g左右小鼠)，第2个小球距导管粗端2．3～2．8 cm，第3个小球最靠近导管粗端，距第2个小球0．3 cm(图1)。

1．2．2 麻醉及手术方法  雄性C57BL／6J小鼠， 腹腔注射戊巴比妥钠(75 mg／kg)后，取俯卧位固定四肢，常规消毒。均在手术显微镜下进行以下操作。Wu方法组：于脊柱L5和L6位置做一纵形正中皮肤切口，术者左手紧紧固定住小鼠骨盆， 用一23G注射器针头穿透L5／6椎体表面肌肉，形成一置管通道。导管内穿入引导钨丝，与脊柱尾端成20—30^。仰角，与脊髓叶1线成20—30^。侧角，穿过椎间组织和硬膜。小鼠出现一过性甩尾或后肢抽动表示导管穿过硬膜。此时将引导钨丝退出2 cm 以避免脊髓损伤。缓慢轻柔向蛛网膜下腔头端置入导管，直至L4脊髓腰膨大处，此时导管细端小球到达肌肉层，用6．0丝线缠绕小球上方导管，将导管与肌肉固定在一起。在颈部做第2个皮肤切口，用眼科剪钝性分离皮下组织，在切口问形成皮下通隧道。导管粗端通过过皮下隧道穿出颈部皮肤切口， 以6-0丝线将导管粗端小球与颈部肌肉固定在一起。仔细缝合所有切口，热凝封闭导管尾段。

改良方法组：于脊柱L5和L6位置做一纵形正中皮肤切口，用眼科镊钝性分离椎体表面肌肉，充分暴露L5／6椎间隙。用30G针头轻轻穿破椎问韧带和硬膜后，稍向两侧扩张，造成一直径约0．6 mm小切口，此时可见蛛网膜下腔清亮脑脊液。用眼科镊将导管细端穿过切口缓慢送入蛛网膜下腔，直导管上第一个小球到达肌肉层。用6-0丝线缠绕小球L方导管，并将导管与椎旁肌肉固定在一起。在颈部做第2个皮肤切口，用眼科剪钝性分离皮下组织后用一直径约0．5 cm套管穿过皮下，打通切口间的皮下隧道。将导管粗端穿过套管，再从颈部切口抽出套管，引导导管穿出颈部皮肤切口， 用6-0丝线缠绕两个小球间的导管，将导管与皮肤固定，并使导管上第二个小球位于皮下，第3个小球位于皮外。仔细缝合所有切口，热凝封闭导管尾段。置管后1 d，检查小鼠是否出现双侧或单侧后肢瘫痪、拉伸后肢缩爪反射减弱或蜷爪等运动功能障碍，均为阴性者，用于后续实验。置管后2 d，向入选小鼠的导管内注入5 ul 20mg／ml利多卡因。若小鼠在注射后15 S内出现后肢运动麻痹，持续10～20 min，则用于行为学实验。处死所有未入选小鼠并行脊髓解剖。置管后第10天进行行为学实验，实验前小鼠均先置于受试房间内2 h以适应实验环境。

1．2．3 运动协调功能使用转轮跑步机测试长期蛛网膜下腔置管对小鼠运动协调功能的影响。先跑步机转速设为最小，小鼠放置于跑步机转轮上，跟随转轮转动而跑动，跑步机转速逐渐增加， 直至小鼠落下转轮，记录小鼠在跑步机上停留的时间。每次测试最长时问为5 min， 间隔15 min，连续测试3次。为排除学习记忆的影响，采用第3次测试的数据为实验结果。

1．2．4 热痛刺激甩尾反应潜伏期使用光热鼠尾测痛仪测试热痛刺激甩尾反应潜伏期。轻柔抓持小鼠制动，将高能光束聚焦于小鼠尾部距尾尖1．5～2 cm处，仪器自动记录小鼠甩尾潜伏期。测试最长时间为20 S， 以免造成组织损伤。

1．2．6 鞘内注射用30G静脉穿刺针连接25ul微量注射器行鞘内注射，静脉注射针内预充满生理盐水。连接注射器后首先抽取生理盐水5ul，然后抽取气泡1ul，最后抽取药物5ul。注射时11ul全部推入，可确保5ul药物药物全部进入蛛网膜下腔，药物与生理盐水间隔1ul气泡，可防止药物被生理盐水稀释。

1．2．5 吗啡镇痛实验向导管内注射盐酸吗啡0.3 nmol(5u1)，注射前，注射后30、60、90、120 min时测试吗啡对热痛刺激甩尾反应潜伏期的影响。结果以最大镇痛效应百分比 (MPE％)表示。计算公式为％MPE=(给药后潜伏期-给药前潜伏期)×100／(20S-给药前潜伏期。

1．2．6 脊髓形态学检查所有行为学实验结束后，向导管内注射1％ 的亚甲蓝5 l后处死小鼠，并解剖脊髓，在手术显微镜下观察脊髓损伤、脊髓血肿情况、亚甲蓝定位及导管位置。

1．3 统计学处理

所有记数资料采用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSSl1.0软件进行统计学处。导管泄露率、术中死亡率、置管失败率、运动功能障碍、脊髓损伤、利多卡因试验阳性率、导管回缩／拔出率、亚甲蓝定位导管位置的比较使用x²检验(校正x²检验或Fisher精确概率法)。吗啡镇痛实验的数据采用重复测量资料的两因素方差分析(2一way ANOVA．RM)，采用Bonferroni法进行两两比较。其他数据均采用使用t检验分析。

2 结果

2．1 置管情况和脊髓解剖

两组小鼠术中死亡率、运动功能障碍、脊髓损伤、利多卡因试验阳性率、亚甲蓝定位导管位置比较，差异均无统计学意义(P>0.10)。导管泄露率、置管失败率、导管回缩／拔出率， 改良方法组显著低于wU方法组(P<0．05)(表1)。

表1置管和脊髓解剖情况

Table 1 Results of catheterization and spinal dissection

2．2 两组小鼠置管后的运动协调功能  两组小鼠置管后第10天，转轮跑步机上运动协调功能测试结果无统计学差异 (P>0．10)(图2)。

图2置管后10d的运动协调功

Figure 2 Motor function 10 days after catheterization

2．3 吗啡镇痛实验

蛛网膜下腔注射吗啡显示强烈的镇痛作用【2-4】。置管后第10天，向两组小鼠导管内注射盐酸吗啡0．3 nmol，于注射前，注射后30、60、90、120 min时测试吗啡对热痛刺激甩尾反应潜伏期的影响，结果显示Wu方法组和改良方法组小鼠MPE％没有统计学差异 (P>0．1)，吗啡作用30 min左右达峰，120 min左右完全消除。吗啡镇痛实验再次确定了两组小鼠导管的位置，并且两种方法置管后鞘内注射吗啡的效果相似(图3)。

3 讨论

鞘内注射是研究脊髓病理生理机制，特别是疼痛在脊髓水平传导和凋节机制的重要方法。鞘内注射不仅可以避免全身用药对脊髓上中枢和传入神经外周末梢的干扰，还是一些不具有全身活性的药物，以及siRNA、反义寡核苷酸、病毒载体等基因功能研究工具的重要给药途径。因此掌握鞘内注射技术对于疼痛研究者十分重要。

鞘内注射的方法有腰椎穿刺和鞘内置管。腰椎穿刺是用针头在啮齿动物腰5／6椎间隙穿刺入蛛网膜下腔后直接进行注射【5，6】，该方法简单易行，应用广泛，但其局限性在于①穿刺过程会造成一定组织损伤，不适于需要要反复穿刺多次给药的研究，也不能用于持续给药研究【1】；② 难以确定药物是否注射入蛛网膜下腔；③操作时需束缚制动动物，会使动物产生急性束缚应激，干扰实验结果。小鼠焦虑易感性高，干扰更加显著。蛛网膜下腔置管行鞘内注射已有J 泛的临床应用，并越来越多的应用于大鼠和其他大型动物的科学研究【7-9】。其优势在于：①适用于需要反复鞘内注射，或者微泵实施持续给药的研究；② 可以通过注射局部麻醉药造成双下肢瘫痪来验证导管位于蛛网膜下腔；③在给药过程中，动物可以自由活动，避免了穿刺疼痛和急性束缚应激的干扰。

小鼠由于品系丰富，生长周期短，生存繁殖能力强，在科学研究，特别是使用基因改造动物的研究中应用广泛。Wu等发明的小鼠蛛网膜 腔长期置管技术，为小鼠在脊髓神经科学研究的应用提供了便利的方法。但在使用中我们也发现以下不足：①Wu的方法使用火焰快速加热导管使其部分熔化，以在导管表面形成小球用于固定导管，侄加热过程常常造成导管损伤泄露；②导管表面的小球可以帮助固定导管防止导管被小鼠拔出，但由于热凝形成的小球体积较小，固定不够牢固，仍有一部分导管被小鼠拔出，并且有时导管还会随动物的活动同缩入皮下；③ 直接使用导丝和导管置管，穿刺时导管细端受脊柱周围组织阻力易弯曲，并且锥间韧带和硬脊膜坚韧，难以穿破，穿破后破口狭小，而导管渐粗，置入时常常受阻，不仅手术时问延长，有时甚至不能成功置入，置管失败率较高。为此，本文对Wu的方法做了以下改进，有效解决了上述问题。

改良方法：①采用parafilm封口膜绕导管做成小球，小球体积较大，这样既能更好的起到固定的作用，又避免了导管损伤造成泄露；②位于导管粗端的第二、三个小球，置管后分别位于颈部皮肤内外，丝线将两个小球间的导管和皮肤固定在一起，既防止了小鼠拔出导管，也使得导管不能回缩；③改良方法先彻底分离椎旁组织，然后以30G的针头穿破椎问韧带和硬脊膜，造成一直径约0．6mm 直观切口，显著降低了导管置入阻力，如感觉不畅，术者易判断是否为导管在蛛网膜下腔受阻，此时可先退出一部分导管，稍改变用力角度尝试再次置入，一般都可成功。本实验结果显示，采用改良方法进行小鼠蛛网膜下腔置管可以避免Wu方法的不足之处，简单易行，成功率高，是研究脊髓药理学，毒理学以及疼痛在脊髓水平分子生物学调节机制的可靠工具，值得推广。

参考文献

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