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Pulmonary protective effects of the ascorbic acid in the rats after gut ischemia－reperfusion injury

郑晓春 陈彦青 黄风怡 彭玲 于荣国 林丽珊 吴晓丹

350001 福州市，福建省立医院麻醉科（郑晓春、陈彦青、黄风怡、彭玲、于荣国、吴晓丹）；福建省心血管病重点实验室（林丽珊）

ZHENG Xiao－chun，CHEN Yan－qing，HUANG Feng－yi，et al. Department of Anesthesiology，Fujian Provincial Hospital，Fuzhou，350001，China.

Abstract

　　Objective：To investigate the pulmonary protective effects of the ascorbic acid in the rats after gut ischemia－reperfusion injury.

　　Methods：Forty－eight SD rats weigting 293±41g were anesthetized by propofol total intravenous anesthesia. Intestinal ischemia－refusion（I/R） injury model was produced by occlusion of superior mesenteric artery （SMA） for 120 min with a clip followed by 60 min or 360 min reperfusion after removal of the clip. The animals were randomly divided into 3 groups with 16 animals in each group：（1） Control group was sham－operated； （2） I/R Group，the animals were subjected to reperfusion after 120 min intestinal ischemia；（3） I/R ⁺ antioxidant Group，200mg/kg of vitamin C was given by tail vein 10－min before mesenteric artery were reperfused after 120 min ischemia. The animals in each group were killed at the end of reperfusion 60 min（n＝8）or 360 min（n＝8）. The MDA，Na⁺－K⁺－ATPase of alveolar cell membrane and water content of lung were measured.

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　　Results：MDA in both I/R groups was higher than group A after reperfusion（P<0.05or<0.01），but the extent of MDA increase in group C was less than group B（P<0.01）. Compared with group A， the Na⁺－K⁺－ATPase in group B increased significantly after 60 min reperfusion， but decreased after 360 min. In group C the ATPase increased continuously after 60 min to 360 min reperfusion and it is better than that in group B（P<0.01）. The water content in group B、C increased significantly after reperfusion （P<0.05），but it did not further increase after 360 min reperfusion in group C. There are no PMN infiltration and mesenchymal swelling in all groups.

　　Conclusion：The oxygen radical and lipid peroxidation were an important mechanism for lung malfunction induced by bowel I/R injury. One of key causes is dysfunction of Na⁺－K⁺－ATPase in alveolar cell membrane. Administration of large dose of ascorbic acid can reduce the water content of lung by preventing dysfunction of Na⁺－K⁺－ATPase.

　　Key words：Ascorbic acid；lung；Intestine，small；Reperfusion injury.

　　缺血再灌注（I/R）损伤对原发器官功能的影响研究较多，而对远隔器官的继发性损伤其研究有待进一步深入。内脏特别是肠道的I/R损伤被认为是多脏器功能不全（MOSF）的引擎，常导致继发性急性肺损伤（ALI）。本研究拟观察抗坏血酸对小肠I/R损伤大鼠肺损伤的保护作用。

　　材料与方法

　　动物和麻醉 选取清洁级成年SD大鼠48只（由浙江省实验动物中心提供），雌雄各半，体重252～335g。腹腔注射异丙酚100mg/kg麻醉诱导，开放尾静脉后置入特制封闭动物实验箱，透明聚乙烯材料，体积0.5m×0.4m×0.5m。离底0.05m中置一手术台，下置40W白炽灯泡，半导体温度传感器（Datex多功能监测仪，芬兰）监测直肠温度，调节手术箱温度使直肠温保持35～36℃。箱底铺厚约0.02m的钠石灰以吸收二氧化碳。四肢安装电极连续监测心电节律。平手术台高度安置吸入氧浓度探头（Datex多功能气体监测仪，芬兰），调节氧气输入流量使实验箱的FiO2范围在40％～50％，大鼠口内置入旁路式二氧化碳探头监测呼气末二氧化碳分压（PETCO2）和呼吸频率。所有实验动物均予以TCI靶控泵（思路高公司，北京）持续输入异丙酚20～35mg kg^-1 h^-1维持麻醉。

　　模型建立和实验步骤 常规消毒后取腹部正中切口入腹，游离并暴露肠系膜上动脉（SMA），参照盛志勇^[1]方法以阻断SMA建立内脏I/R损伤动物模型。所有大鼠随机分3组：假手术组（A组，n＝16）：开腹仅暴露SMA后关腹，经尾静脉缓慢注射生理盐水1ml；I/R组（B组，n＝16）：SMA阻断2h后再灌注6h，经尾静脉缓慢注射生理盐水1ml；抗坏血酸组（C组，n＝16）：缺血再灌注同B组，再灌注前10min经尾静脉缓慢注射抗坏血酸，（苏州第六制药厂）200mg/kg，生理盐水稀释至1ml。每组随机选取一半大鼠分别于再灌注1h或6h后处死取材。

　　肺组织匀浆制备 大鼠放血处死后即刻开胸取左肺组织干湿重法测量肺组织含水率。同时取右肺下叶新鲜组织1g在－18℃条件下编号保存。单盲处理后交实验室成批制成肺组织匀浆，即将肺组织用冰冷的Tris－HCl缓冲液（50mmol/L，含10mmol/L MgCl2，pH7.4）洗去血污，剔除支气管及其周围结缔组织，称重后剪碎，按1：100比例（重量：容积）加入缓冲液，在冰浴中用内切式组织匀浆器（5 000r/min，15s×2次）匀浆，然后经4℃、400g×10min离心，取上清超速离心（40 000g×15min，4℃），用Tris－HCl缓冲液洗涤后再离心，沉淀用上述缓冲液重悬，考马兰法蛋白定量后备用。

　　Na⁺－K⁺－ATP酶活性测定 取适量膜制剂，用定磷法（试剂盒由南京建成生物工程研究所提供）测定Na⁺－K⁺－ATP酶活性，单位表示为μmmoPi mg.pro^－1 h^－1。

　　MDA测定 按照试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书依次加入各种试剂至反应完成后，用721分光光度计比色，依据公式计算含量。

　　病理标本经过单盲处理后在光镜下观察肺中性粒细胞（PMN）浸润和间质水肿程度。

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　　统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结　果

　　与A组比较，B、C组MDA再灌注1、6h后均升高，B组再灌注6h后MDA较1h时升高；与B组比较，C组再灌注6h后MDA较低（P<0.05或0.01），再灌注1h时差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

A组Na⁺－K⁺－ATP酶活性在再灌注6h比1h时升高；与A组比较，B组再灌注1h后Na⁺－K⁺－ATP酶活性升高而6h后下降，C组再灌注1、6h均升高；C组再灌注6h后其活性高于B组（P<0.05或0.01）。

B、C组再灌注1、6h后肺含水率较A组均有增加；与再灌注1h比较，再灌注6h后B组继续升高；与C组比较，B组再灌注6h后肺含水率较低（P<0.05或0.01）。

　　光镜下A组未见特殊改变，B组肺泡壁毛细血管轻度扩张，C组的部分标本还出现轻微充血现象。各组均未见PMN浸润和间质肿胀征象。

讨　论

　　循环低灌注状态下肠道系统极易受损，Liu等^[2]发现在肝门阻断120min后，80％的大鼠死于肝外多脏器损伤，死亡原因占首位的是呼吸功能衰竭（30％）。内脏I/R损伤后以肠源性的氧自由基（ROS）为中心可引起链锁反应，多因素造成原发和远隔组织损伤^[3]。肺细胞膜脂质中主要成分为不饱和脂肪酸（PUFA），被引发脂质过氧化作用，形成MDA等引起细胞损伤，这是氧源性伤害的重要标志之一^[4]。相关研究报道以肺组织髓过氧化酶（MPO）活性和ICAM^－1基因表达增加证实了SMA阻断60min再灌注120min后可引起肺损伤^[5]，本实验中肠缺血时间增加1倍，再灌注1h后肺组织MDA即出现升高，6h后的升幅达到3倍，提示缺血时间延长后肺组织在氧源性因子攻击下损伤更趋严重，后期可能发展成急性肺损伤甚至急性呼吸窘迫综合征。

　　内脏I/R后生成ROS，肺因灌注特点和微血管特殊结构而成为首要的受攻击脏器。肺泡上皮Ⅱ型细胞的Na⁺－K⁺－ATP酶在肺泡液体主动转运功能中占主导地位。本研究中即使在I/R损伤的早期（1h），肺组织含水率尚未升高，而该酶活性即增加，提示损伤后的早期阶段机体应激使Na⁺－K⁺－ATP酶代偿能力加强，延长再灌注时间使其代偿作用达峰后下降，胞内Na⁺升高。