背景：β淀粉样蛋白（Aβ）的过度蓄积是阿尔茨海默病的发病机制之一。异氟烷是一种常用的吸入麻醉药，曾经有异氟烷可增加嗜铬细胞瘤细胞内Aβ的寡聚化反应和细胞毒性的报道。为了探讨异氟烷在AD发病机制和术后认知障碍（POCD）中的可能作用，我们研究了异氟烷在临床应用浓度（2%）下是否能诱导过度表达人APP的人H4神经胶质瘤细胞凋亡、改变APP加工处理过程和增加Aβ的生成 。

方法：2％异氟烷处理稳定转染表达全长野生型淀粉样前蛋白（APP）的人H4神经胶质瘤细胞（H4-APP-FL）6小时后，收集细胞及细胞裂解液。使用定量蛋白质印迹法、细胞活力试剂盒和三明治酶联免疫吸附法检测caspase-3的激活状态、APP加工处理过程、细胞活力及Aβ的水平。应用抗Aβ抗体6E10 （50 ng/ml） 和 4G8 （50 ng/ml）与H4-APP-FL 细胞共孵育1小时，然后用2% 异氟烷处理6小时的方法，来检测Aβ对caspase-3活化和凋亡的影响。在交互作用实验中，细胞在2%异氟烷处理前1小时给予250 NmDTPA（二乙烯三胺五乙酸，γ-分泌酶抑制剂）、100μM 苄氧羰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-[O-甲酰]-氟甲基酮（Z-VAD， caspase抑制剂）、15μM Aβ、50 ng/ml 6E10和50 ng/ml 4G8。实验的对照条件为5% CO2 、21% O2和氮平衡，因为这样不会影响caspase-3 的激活状态、细胞活力、APP的加工处理过程或Aβ的生成。所有细胞系使用含9％热灭活胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的DEME高糖培养基进行培养。稳定转染的H4细胞还额外补充了200 μg/ml G418。

结果：我们首先评价了2%的异氟烷对H4-APP-FL细胞caspase-3激活，细胞活力，APP加工处理过程和Aβ水平的影响。在caspase-3激活和细胞活力方面，caspase-3 免疫印迹表明，与对照条件处理的细胞相比，2％异氟烷处理的H4-APP-FL细胞的活化caspase-3片断增加和 全长（FL）caspase-3减少。切割的（活化的）caspase-3 片断（17–19 kd）与全长 caspase-3 （35 kd）比率的定量实验表明，与对照条件相比异氟烷处理导致caspase-3激活增加249％（P < 0.01）。2％异氟烷处理同时也降低了H4-APP-FL细胞25％的细胞活力（P < 0.05）。这些结果表明异氟烷在临床应用浓度（2%）下诱导H4-APP-FL细胞凋亡。在APP加工处理过程和Aβ水平方面，与对照条件处理的细胞比较， 2％异氟烷导致H4-APP-FL细胞淀粉样前蛋白C-末端片断水平（APP-CTFs）水平下降。与此相反，异氟烷处理对淀粉样前蛋白全长（APP-FL）量的

影响没有明显差异。对APP-CTFs和APP-FL比率的定量实验表明，与对照条件处理的细胞比较，异氟烷处理降低APP-CTFs与APP-FL的比率达60％（P < 0.05）。与对照条件相比，2%异氟烷使Aβ40（193 vs. 50 pg/ml）和Aβ42 （83 vs. 24 pg/ml）的水平明显增加约3～4倍（P < 0.05, P < 0.01）。总之，2%异氟烷通过激活H4-APP-FL细胞的caspase-3引起细胞凋亡，同时2%异氟烷降低了细胞活力，降低淀粉样前蛋白C-末端片断水平（APP-CTFs），改变APP的加工处理过程和增加Aβ的产生。接下来检测异氟烷诱导的caspase-3激活增加和凋亡是否依赖于Aβ产物的增加。结果caspase-3片断与 FL caspase-3比率的定量蛋白质印迹表明2% 异氟烷加盐水可使caspase-3 激活增加289％（与对照条件相比）（P < 0.01）。同样，2% 异氟烷加抗-Aβ抗体6E10和4G8仍可使caspase-3 激活增加295%（与对照条件相比）（P < 0.01）。我们同样对异氟烷诱导的caspase-3活化是否依赖 FL-APP的过度表达进行了检测。我们选用了过度表达APP-C99 （H4-APP-C99 细胞）的H4细胞进行研究，结果表明2% 异氟烷处理的H4-APP-C99 细胞的caspase-3活化片断增加了320％（与对照条件相比）（P < 0.01）。这些结果提示异氟烷诱导的凋亡不依赖APP-FL水平的增加。最后检测γ-分泌酶对caspase-3活化的影响。检测γ-分泌酶抑制剂DAPT（增加APP-CTFs水平，降低Aβ水平）对异氟烷诱导caspase活化的影响。与异氟烷单独处理相比，DAPT加异氟烷处理使caspase活化的程度更大，而DAPT单独处理却不能诱导caspase活化。因为DAPT加异氟烷增加APP-CTFs 水平，这些数据提示APP-CTFs水平增加可能增加caspase的活化。

结论：异氟烷在临床应用浓度下可诱导凋亡，改变APP的加工处理过程，并增加人神经胶质瘤细胞系Aβ的产生。APP加工处理过程的改变在阿尔茨海默病的发病中起着重要作用，所以此项研究提示吸入麻醉药可能增加老年合并脑水平Aβ升高的患者术后认知功能障碍（POCD）的发生的危险性。