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阿片受体基因克隆研究进展
| 自从20世纪70年代发现阿片受体以来，它们的药理学特征已得到充分阐述，但其分子生物学特性研究却未能取得很大进展，这主要是由于阿片受体很难在保持配体结合活性的条件下被纯化。尽管如此，阿片受体的纯化和分子生物学的研究仍取得了实质性进步，尤其是非离子变性剂 CHAPS的使用[1]。1992年，Evans和Kieffer等[2,3]成功克隆了小鼠δ 受体基因后，关于阿片受体的分子生物学研究有了更加丰硕的成果。目前，3 种阿片受体的基因均已被克隆，本文将扼要介绍阿片受体的结构功能及基因克隆等有关方面的内容。 一、阿片及阿片受体的发现 1803年[4]由罂粟生物碱分离出的物质晶体，被证实是天然阿片的镇痛活性成份，称为吗啡。吗啡的立体化学结构是其与机体特异部位相互作用产生镇痛所必须。通过吗啡、酮唑辛和SKF-10047等一组激动药[5,6]所产生的不同药理活性，确定了三种阿片类药物综合症，分别命名μ，κ和σ原型，由此导致了μ，κ和σ三种阿片受体的发现。后来发现与SKF-10047相关的σ型综合症不能被普通阿片拮抗剂纳洛酮（naloxone）所阻断，因此σ型受体不再被认为是阿片受体家族的成员。δ型受体是由Richard小组[7]在研究内源性阿片肽和内啡肽的效应时发现的。经过近30年实验室研究，对μ，κ和δ型受体的认识已较清楚，其基因编码已被克隆，这3种受体称为“经典型阿片受体”。最近cDNA编码一种称之为“孤立阿片”受体，经鉴定与经典阿片受体有高度同源性，它的结构基团是阿片受体，因此称其为阿片样受体（opioid receptor-like,ORL1）。有药理学迹象表明每种阿片受体存在亚型，以及其他新型、较少了解的阿片受体ε、λ、ι和ξ。 二、经典阿片受体 三种经典阿片受体μ，κ和δ阿片受体被确认后，发现在脑内分布广泛但不均匀。这些受体分布在痛觉传导区以及与情绪和行为有关的区域，集中分布在导水管周围灰质、内侧丘脑、杏仁核和脊髓胶质区。这些复杂的受体可以被不同的激动剂激活，产生不同的生物效应。例如，主要分布于脑干的μ受体被吗啡激活后，可产生镇痛和呼吸抑制等作用，而主要分布于大脑皮质的κ受体只产生镇痛作用而不抑制呼吸。然而不同阿片受体在中枢神经系统的分布，以及对不同阿片配体结合能力存在差异。阿片受体的内源性配体为脑啡肽、内啡肽和强啡肽，它们分别由不同的基因编码。这些五肽对阿片受体的亲和力不同，但三者均可与一种以上的阿片受体结合。其中，脑啡肽对δ型受体有较强的选择性，被认为是其内源性配体。强啡肽对κ型受体选择性较强，是其内源性配体。μ型受体的内源性配体直到1997年才被发现称为内啡肽或内源性吗啡（endomorphine）。内源性吗啡在中枢神经系统与μ-阿片受体呈镜像分布，对μ受体的结合力比对κ和δ受体的结合力高100倍。 三、经典阿片受体的基因克隆 最近人们克隆出三种典型的阿片类受体μ，κ和δ，并确定了其核苷酸序列。阿片受体属于G蛋白耦联受体大类，该类受体具有相同的基本结构：一个细胞外氨基端区域，七个跨膜域以及一个细胞内羧基端尾区。 克隆得到的阿片类受体有高度内源性，65％的氨基酸序列是相似的。最大的不同在于细胞外环、氨基端和羧基端区域。阿片受体的配体是二价的，一部分调节信号的传导，另一部分决定受体的选择性。它们分别称为信号区和结合区。信号的传导与跨膜域有关，而细胞外环的作用与配体从结合部位分离有关。μ受体和δ受体的第一个细胞外环只有7个氨基酸不同，两者最主要的区别在于108位点的一个氨基酸差异。δ受体中该位点的缬氨酸被门冬酰胺替换后，即可与μ受体配体DAMGO以高亲和力结合。受体的结合隐穴由多个跨膜域和细胞外环的多氨基酸立体结构形成。拮抗剂与受体结合后，不产生激活受体所需的构像改变。但单个氨基酸的改变（如TM4区亮氨酸取代丝氨酸）可使拮抗剂与受体作用后产生激动剂的作用。 3.1 μ受体的基因克隆 Chen等首先从大鼠脑cDNA文库克隆了μ受体[8]。该受体由398个氨基酸残基组成，与小鼠δ和κ受体具有较高的同源性，尤其是第2、3、7 跨膜区和第2胞内环区，而1、4、5跨膜区则明显不同。第2和第3胞内环区是G蛋白结合区域，因此这些区域在3种阿片受体中的高度相似性表明与G蛋白相互作用的可能性。3种受体结构的最大差异部分在氨基端和羧基端及第2、3胞外环区，这些区域可能是阿片受体配体结合区，即不同配体选择性的结构基础，该推测可通过直接点突变得到证实。另外，3种受体的胞外氨基端的天冬氨酸N－糖基化的位点数目不同，δ和κ受体中有2个潜在的N-糖基化位点，而μ受体中有5个，这意味着这些受体可能具有不同的表观分子量并在糖基化的过程中具有组织特异性差异。COS-7细胞中表达的μ受体与μ型选择性配体亲和力很高，而与δ和κ型选择性配体只有较低的结合力。克隆的μ受体介导毛喉毒素刺激cAMP形成抑制，表明其与腺苷酸环化酶偶联。RNA印迹显示大鼠脑中μ受体mRNA长度大于10kb [9]，在中脑和纹状体中观察到高水平的μ受体mRNA表达而脑皮层则表达量很低[10]，在小脑、心、肺、肝和肾中未检测到μ受体mRNA的存在。原位杂交显示μ受体mRNA 呈非均一分布，在基底神经节中的高水平表达暗示了该受体在运动控制中的作用。在丘脑中也观测到了高水平的μ受体mRNA，这可能是μ型受体激动剂调节脑中疼痛传导的分子结构基础。Fukuda等[9]采用Northern印迹揭示δ受体mRNA比μ受体mRNA具有更大的非均一性与丰富性。Wang等[11]通过RNase保护分析发现μ受体 mRNA 在许多脑区包括丘脑、脑皮质和纹状体中明显存在，而原位杂交中只有丘脑核中有显著的μ受体mRNA。 3.2 δ受体的基因克隆 Evans和Kieffer两个实验小组采用了几乎相同的方法克隆了小鼠δ受体的基因[2,3]，即通过小鼠成神经细胞瘤NG108-15X大鼠神经胶质细胞制备cDNA以及瞬时表达载体构建cDNA文库。克隆的小鼠δ受体由372个氨基酸残基组成，相对分子质量约为40 000，这与天然受体的58 000存在一定的差异，该差异主要与受体是否糖基化有关。分析表明，受体氨基端有两个糖基化位点。该受体的氨基酸序列与生长抑素、血管加压素、白介素-8分别有37%、31%和22%的一致性，与大鼠和人的δ受体分别有97%和93%的同源性。小鼠和人的δ受体基因结构相似，由4 个外显子和9 个内含子组成，在基因上游5’侧翼区存在多个转录结合位点，如SP1、AP2、NF-κB等[12,13]。亲疏水性及G 蛋白偶联受体同源性分析表明该受体有7个跨膜区，胞内环和羧基端有多个潜在的磷酸化位点，可能对介导阿片类效应起重要作用。克隆的δ受体具有天然受体的特征，对甲啡肽和亮啡肽的亲和力大于强啡肽，与δ型选择性配体亲和力很高，与κ和μ型选择性配体亲和力则很低，同时对纳洛酮亲和力也很低克隆的δ受体能够介导埃托菲DPDPE(Tyr-D-Phe-Gly-Phe-D-Phe）对腺苷酸环化酶的抑制作用，且这种抑制可被纳洛酮阻断。Evans等表明在NG108-15细胞和小鼠及大鼠脑内的δ 受体的RNA转录产物具有非均一性，大小1.4-9kb不等。RNA印迹未检测到小鼠肝中δ受体的存在。 3.3 κ受体的基因克隆 随着δ受体的克隆，Yasuda等报道了小鼠脑κ受体cDNA克隆的分离和功能鉴定。该受体克隆是在生长抑素受体亚型杂交筛选过程中偶然得到的[14]。小鼠κ受体由380 个氨基酸残基组成，与小鼠δ受体具有很高同源性（61%），同源区包括第2、3、7跨膜区和第2胞内环区，而所有的胞外区和羧基端同源性很低。同δ受体一样，κ受体氨基端胞外区有2个N-糖基化位点。在胞内环区及羧基端存在一些磷酸化位点。另外，第1和第2 胞外环区各含有一个彼此间能够形成二硫键的Cys。Minami等[15]克隆了大鼠κ受体，大鼠κ受体与小鼠的δ和κ受体分别有59％和98％的同源性，他们通过Northern 印迹在大鼠脑部检测到约5.8kb的κ受体mRNA，心、脾、肺、肝、骨骼肌及肾中未发现κ受体mRNA 的存在。另外，其他4个实验小组也成功克隆了大鼠κ受体，在这5种大鼠κ受体cDNA克隆中有7个核苷酸和2个氨基酸差异，Minami[14]报道42位氨基酸为Leu，其余则报道为Val；Li[16]报道345位氨基酸Tyr，其余则报道为Cys，后者可能性更大，因为Cys是一个潜在的棕榈酸化位点，该位点的棕榈酸化可将受体锚定于细胞质膜表面，使第4胞质环靠近第3胞质环，而第3胞质环结合于G蛋白上。5个实验小组都认为第二个可能的氨基酸残基棕榈酸化位点为第340位Cys。Xie等[17]克隆了豚鼠κ受体，该κ受体与小鼠和大鼠的κ受体有89%的同源性,明显低于小鼠与大鼠κ受体之间的同源性。氨基酸差异主要出现在氨基端，而羧基端很少。另外值得注意的是第4跨膜区的186位氨基酸由小鼠和大鼠κ受体中的Ala, 取代为Ser。克隆的κ 受体与强啡肽及κ 型选择性配体如U69593、U50488有很高的亲和力，而与脑啡肽亲和力很低，这和天然受体相同。同δ受体一样，克隆的κ受体也介导cAMP的生成抑制作用，并且该受体亦介导Ca2+通道活性的抑制。 四、阿片样受体（ORL1） 阿片受体被克隆后不久，学者们又分离出一种具有G-蛋白-耦联受体典型结构的蛋白，这种蛋白与经典阿片受体的结构具有同源性，被接受位阿片受体家族的成员，称为阿片样受体（ORL1）[18]。但ORL1与经典阿片受体没有相应的药理学同源性，甚至于μ-，κ-和δ-受体有高度均一亲和力的非选择性配体，对ORL1受体也只有很低的亲和力。由于这个原因，开始没有发现ORL1的内源性配体，故称其为“孤立阿片受体”。“ 孤立阿片受体”并没有孤立很长时间，不久确认新发现的70肽菌素为其内源性配体，并被命名为伤害感受素（naciceptin），其序列的起始端和结束端氨基酸分别为苯丙氨酸（F）和谷氨酰胺（Q），又称之为FQ孤啡肽。FQ孤啡肽引起的细胞反应与经典型阿片受体激活反应相似。动物的伤害感受素则产生一系列与其他阿片类不同的生物效应。鞘内注射伤害感受素可产生镇痛作用，但脑室内给药则引起痛觉过敏并拮抗阿片类镇痛作用。伤害感受素刺激摄食、诱发焦虑，并参与记忆和中枢信息加工。 虽然有些研究结果提示有ORL1亚型的存在，但现在就作出此结论还为时尚早。最可靠的受体药理学定义需根据受体拮抗剂亲和力的差异，而对于ORL1受体缺乏有用的拮抗剂。尽管有伤害感受素N-末端十三肽的合成类似物可以作为选择性拮抗剂，当增加用量时又倾向于产生激动作用。同时也没有理由说这个肽对外周的ORL1受体具有抗作用。 五、其他阿片受体 除了μ-，δ-，κ-和ORL1-受体外，推测还有几种其他阿片受体，如ε-，λ-，ι-和 ζ-受体。ε-受体，对β－内啡肽具有特异性。兔回肠有ι-受体，对脑啡肽有高度亲和力但又不同于δ-受体。在新鲜鼠膜碎片有一种很不稳λ结合位点，对4,5-环氧左马南有高度亲和力。对ε-，λ-，ι-和ζ-受体特性了解的很少。只有得到进一步的实验证据，尤其是它们特异性cDNAs得到分离，这些阿片受体才能得到更广泛的认可。 六、阿片受体的配体识别 阿片受体的基因克隆为阐明不同受体区域和个别氨基酸如何进行配体识别提供了一条途径。阿片受体结构可通过嵌合体进行修饰，即某一受体的部分氨基酸序列被另一受体相应位置的氨基酸所取代。另外，直接点突变也是研究个别氨基酸对受体功能影响的方法。Reisine等[19,20]在小鼠δ受体的3个位点处分别进行了点突变，结果表明，有2个位点突变后的δ受体与选择性激动剂的结合能力明显下降，而另一个位点突变后的情况正好相反，但3种突变与拮抗剂的结合能力均无明显变化，这表明受体对激动剂和拮抗剂的识别区域不同，δ 和κ受体嵌合体的研究为此提供了据。将小鼠κ受体部分序列与δ受体部分序列融合后（二者颠倒可形成互补嵌合体），每一种嵌合体只识别一类配体（δ或κ型），而二者均不与[3H]纳洛酮结合，这说明δ和κ受体识别激动剂与纳洛酮的位点不同。目前，这些位点的确切作用即直接参与配体结合还是间接通过变构机制调节配体识别区域的构象，仍不清楚。有证据表明δ受体的Asp95 可能不直接参与配体识别而参与配体结合的钠离子调控用。另外，δ受体的Asp128可能参与了配体识别，但并非受体的其他部分也参与了配体识别，尽管肽类配体识别需要许多受体残基的接触，这些残基可能在不同型受体之间确定配体选择性方面起作用。 脑啡肽对δ型受体有较强的选择性，被认为是δ型受体的内源性配体；而强啡肽对κ型受体选择性较强，被认为是κ型受体性配体；μ型受体的内源性配体直到1997年才被发现[21]，称为内吗啡肽（4 肽），其与阿片肽N端1、4位相同，经鉴定，它是目前所知的对μ型受体亲和力和选择性最高的生物活性肽。3 种阿片受体皆可耦联腺苷酸环化酶并抑制cAMP的形成，该抑制效应通过百日咳毒素敏感GTP结合蛋白即G蛋白的介导。另外，这些阿片受体也可介导Ca2+和K+通道活性。 六、阿片受体药理学效应 |
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