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第三代腺病毒载体重组构建的优化
随着腺病毒载体的研发深入，第三代腺病毒载体已经克服了前两代的一些不足， 以其高容量、能够长时间转基因表达以及低毒性和低免疫原性的优点被广泛应用于基因治疗的研究。然而，重组构建第三代腺病毒载体费工费时，难以大规模生产，为了改变这种状况，近年来已经研发出许多优化的方案， 本文就此予以综述。 由于第三代腺病毒去除了所有编码基因和基因组复制所需的蛋白，所以壳体的生成和包装均需反向提供。这就需要第三代腺病毒与辅助病毒同时感染，但由于辅助病毒和第三代腺病毒具有相同的壳体，所以在纯化前必须将两者分离， 并尽量减少辅助基因组自身的包装效率。可通过使包装信号突变，利用基因组不同大小使其过大或过小而不能有效包装，以及载体生产过程中将辅助病毒的包装信号特异性消除等方法实现[7-9]。早期利用含有不完全包装信号的依赖辅助腺病毒，虽基因组序列广泛被删除，但仍具有一些编码序列［7］。使用野生型腺病毒作为辅助病毒与第三代腺病毒共同转染使两种病毒都被繁殖，在几代之后，使用氯化铯密度梯度方法进行第三代腺病毒的纯化，但是辅助病毒和两种病毒的多种重组序列都可以被检出。这样大规模生产和纯化就存在严重的不足，所以出现了一系列优化方法。 (1) Cre-loxP重组系统 使用Cre重组酶将包装信号特异性除去是重要改进。Parks等[9]提出在辅助病毒的包装信号两侧各插入一个loxP位点，扩增在Cre重组酶表达细胞株(293Cre)中进行。当辅助病毒进入细胞后，它的包装信号便被切断从而阻止它的基因组进入到病毒颗粒中，但保留了生产第三代腺病毒所需重要蛋白的所有编码序列。利用这一方法只能将辅助病毒污染控制在0.1-10%的水平，可能是由于重组酶的活力较低和内源性较差导致消除包装信号的效率较低； 也可能是由于腺病毒引起宿主细胞关闭或Cre重组酶较高的细胞毒性所致。尽管辅助病毒污染率较低，但是辅助病毒引起的潜在细胞毒性仍值得注意，尤其在需要大剂量辅助病毒时[10]。Palmer[7]对Cre-loxP系统进行了改进，为了避免在第三代腺病毒载体重组过程中具有RCA的生成，将辅助病毒包装信号进行逆转，使辅助病毒污染率降低至0.02-0.1%。 (2) FLP- frt 重组系统 FLP重组酶是酵母特异性位点重组酶，可以剪切包装蛋白。Philip等[11]研发出新型的FLP表达细胞株(239FLP和239CreFLP)，并在辅助病毒包装信号两侧加入了frt位点，构成FLP-frt重组系统。据报道[12]FLP 重组酶对DNA 的剪切效率接近100%，而Cre 重组酶的只能达到80%，所以使用FLP-frt 系统可能优于Cre-LoxP系统。Umana[13]对FLP-frt系统进一步改进，发现应用色谱纯化技术可以大批量生产出第三代腺病毒载体，并且不需要传统的氯化铯梯度离心法纯化即可得到高效价的病毒载体。然而，Cre和FLP是删除包装信号的双向重组酶，它们还可使包装信号再次表达，增加辅助病毒污染率，提高它们的删除能力也会增加反向的作用，所以必须使用单向重组酶[14]。 (3) φC31-attB/attP重组系统 Alba[14]提出使用单向重组酶，φC31便是减低辅助病毒污染率的另一个重组酶，由于它能够识别attB/attP的同源染色体序列，所以也具有293细胞株Cre同样的剪切能力。当φC31切去包装信号两侧插入的attB/attP序列时，便可得到attR/attL而阻止反向重组，所以蕴含有attB/attP包裹包装信号的辅助病毒可能会引出一个新的第三代腺病毒生成系统。 (4) 容量限制型蛋白IX－缺失辅助细胞 Sargent等[8]利用腺病毒包装容量的限制来降低辅助病毒的污染率。因为重组腺病毒基因组长度在野生型腺病毒的75-105%之间时才能够被包装形成病毒颗粒，超出这一范围腺病毒基因就会发生重排，使最终基因长度维持在27－37.8%，所以推测壳体蛋白的不稳定是限制外基因发生重排的主要原因。IX蛋白(pIX)参与腺病毒壳体的稳定，在包装全长病毒基因组中起着重要作用。当腺病毒缺失pIX时，它的壳体就会变得对热敏感而不稳定，包装容量降低至35kb。根据以上原则，设计出序列长度大于35kb但缺失了pIX的辅助病毒，该病毒能够在提供pIX的293 细胞中复制，但由于生成的辅助病毒太大而无法包装，从而降低辅助病毒的污染。 (5) 非腺病毒载体作辅助病毒 Cheshenko[15]利用包含有大部分腺病毒基因的杆状病毒作为辅助病毒感染293Cre细胞。Cre重组酶作用于杆状病毒上的LoxP 位点，将杆状病毒分为骨架部分和腺病毒两部分。前者保持在转录水平，不会被复制；而后者则可以提供第三代腺病毒的辅助病毒所有功能，与携带目的基因的质粒一起构建出第三代腺病毒载体。这种设计使第三代腺病毒避免了辅助病毒的污染，但是在终病毒中出现了RCA。 (6) Av1S4BflxFE3辅助病毒 Sakhuja等[16]重组构建出一种新的辅助病毒Av1S4BflxFE3，并在PER.C6基础上生产出一种新的替代细胞株—PER.C6-Cre细胞株。Av1S4BflxFE3辅助病毒包含整个AD5的E3编码区，拥有从细菌人工染色体克隆C0500H20得到的4370 bp的stuffer DNA，但去除了转基因表达盒。使用这种新的辅助病毒可以进一步优化载体生产过程。Av1S4BflxFE3拥有较大的基因组(37.3kb)，容易与第三代病毒分离，转染后第二代使用氯化铯滴度离心法即可使菌株纯化，避免第三代之后载体制备中污染的进一步扩大，从而提高了产品的效价。采用PER.C6-Cre细胞株的最大优点就是避免了以前构建方法中同源重组产生RCA的问题， 因为在这种细胞株中辅助病毒、第三代病毒和细胞系之间的所有同源物质已经被清除，所以生产的第三代病毒中没有RCA出现。由于PER.C6-Cre细胞株可以高效表达Cre重组酶，适用于任何血清悬浮培养液，从而使第三代病毒在生物反应器中的生产具有了可行性。通过PCR测定混有辅助病毒的第三代病毒扩增物，发现不管完整的还是突变的以及缺乏包装信号的辅助病毒均可被检测出来。研究显示该系统不仅有较高的生产率，而且辅助病毒(包括突变的和未突变的) 的污染大大降低，也没有RCA 出现。 另外，有研究者对第三代病毒载体质粒和辅助基因组质粒(病毒)共转染、转染/感染等生产方法进行了比较，发现用具有相同复制原点的第三代病毒载体质粒和辅助基因组质粒共转染生产体系可以提高病毒的生产[17]。如将基因组与腺病毒的末端蛋白相连后，载体的生产效率要比无末端蛋白时高数倍；并且Cre重组酶表达细胞株的限制性暴露，可以有效减少辅助病毒的重排，从而增加第三代病毒载体的产量[17]。 四．展望 第三代腺病毒载体已经广泛用于治疗各种动物实验模型，如动脉粥样硬化、恶性肿瘤、骨损伤修复、血友病和肥胖症等。但在疼痛治疗方面，目前还仅仅限于使用第一代腺病毒载体。如能将第三代腺病毒载体携带治疗基因运用于疼痛的基因治疗，它必将成为治疗各种疼痛的有效方法。 总之，随着对第三代腺病毒载体重组构建研究的不断深入，逐步改进优化方案，在不久的将来可实现第三代病毒载体大规模生产，从而实现以前两代腺病毒无法比拟的优越性广泛应用于基因治疗。 |
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