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心肌KATP通道与缺血预处理
时间：2010-08-23 17:52:44 来源： 作者：
| 1.IPC的研究现状 1.1 IPC现象的发现 IPC是一种适应性的生物学现象，即心脏组织（或各种其它组织）经历一次或多次短暂的缺血再灌注后，能有效抵抗随后更长时间的缺血再灌注损伤。这种适应性现象首次被Murry等描述[1]，又被称为经典或早期IPC。IPC的心肌保护主要表现为减少缺血心肌的梗死面积[2]和再灌注性心率失常[3]，并在各种动物中得到证实。早期IPC是一个短期保护，抗缺血作用持续1-3小时。1993年Kuzuya在狗再体灌注模型中发现心肌缺血再灌注24小时后，再次出现抗心肌梗死面积的保护作用，即延迟IPC[4]，延迟IPC一般在IPC后12到24小时出现，可持续48至96小时。又被称为第二窗保护作用。以后发现许多物质或药物可模拟IPC的保护作用，并应用于各种动物模型中，以此研究IPC的确切机制。 1.2 IPC的机制研究 1.2.1 膜受体 IPC的具体的分子机制还未完全阐明。但目前大量的研究认为：IPC能使缺血心肌产生内源性的物质如腺苷、α肾上腺素、阿片肽及缓激肽等。这些物质作用于相应的膜受体如腺苷A1受体[5]、α肾上腺素、δ阿片肽以及缓激肽等受体，参与IPC的启动机制。Liu等首先证实作为触发物质的内源性腺苷的释放，并与腺苷A1受体结合，参与了兔心肌缺血预处理的保护作用[6]。适当增加腺苷A1受体的表达（约为正常的30倍左右），可增加大鼠心脏对缺血再灌注损伤的抵抗力，减少心肌梗死面积和再灌注后心脏收缩功能障碍[7]。这些触发物质的释放依动物种族和发动IP的缺血程度和时间的不同而改变[8]。如Schulz[9]等发现：缓激肽在较为弱的IP刺激时，是主要的触发介质，而腺苷多在IP刺激较强时出现。 1.2.2 信号传导通路 在心肌预处理中，可能存在多个蛋白级联信号传导通路，包括酪氨酸激酶、蛋白激酶C、磷脂酰肌醇激酶-3、p-38丝裂素激活蛋白激酶（MAPK）和JAK/STAT等[10]。并且首次在兔心的实验中发现腺苷、缓激肽和阿片肽受体的激活最终都聚集于Gi蛋白和PKC；蛋白激酶C(PKC)的阻滞剂如多粘菌素B的应用废除了IPC的心肌保护作用,而PKC的激动剂PMA或OAG均能模拟IPC的心肌保护作用[11]。在实验中还发现IPC通过增加PKC-ε的移位传递内源性保护信号的[12]，但单独阻滞PKC不能阻止预处理对猪心的保护作用[13]，当联合阻滞PKC和酪氨酸激酶时，就能有效阻滞该保护作用，表明在这样的内源性保护机制中存在一个复杂的蛋白激酶级联反应。并且发现不是所有的Gi耦联受体通过同一个传导通路向下传递预处理的保护信号的。例如5-HD能完全阻滞缓激肽和阿片肽对离体兔心的保护而不能阻止腺苷的这种保护作用[14]。 1.2.3 终末效应器 相当多的实验都认为KATP通道在IPC中起着终末效应器的作用。KATP通道的直接激活能产生心肌保护作用，Bimakalin、Cromokalim缺血前应用能限制狗心脏的梗死面积[15，16，17]，吡那地尔能增加兔心对缺血的抵抗，表明KATP通道的开放可能扮演了急性IPC中信号传导通路的最后角色。然而，最新的研究也认为KATP通道的开放在延迟IPC中起着触发器和/或信号传导因子的双重作用。在兔离体心脏的实验中发现：KATP通道的开放通过氧自由基的产生以及随后激酶的激活而产生了心肌保护作用[18]，所以推测KATP通道可能是通过激活多个激酶途径中的一条并从而产生氧自由基而发挥作用[18]。 1.3 IPC在临床的应用 在行冠状动脉旁路移植手术前，先予两次重复缺血两分钟，再灌注三分钟预处理后，病人术后再灌注早期和24小时后，室颤发生率明显减少，证明早期和延迟IPC在人类中依然存在保护作用[3]，并在临床上已被逐渐得到应用。 2.KATP通道的发现 1983年，Noma用膜片钳技术,首先在豚鼠的心肌细胞中发现了一种对ATP敏感的钾通道（KATP）[19],继这个里程碑的发现后，该通道还被观察到存在于许多其它组织中，如脑、平滑肌、骨骼肌、肠、肾和胰腺等，它在细胞的新陈代谢和膜电位活动之间起着耦合作用,所以功能上又被称为细胞内的“新陈代谢传感器”，又是肌肉收缩和腺体分泌的重要调节器。在心肌组织中，KATP通道被认为是心肌保护的调节中枢。 3.KATP通道的结构及特性 KATP通道的分布目前认为主要有两种:分布于细胞膜的胞膜KATP通道（sarcKATP）和分布于线粒体膜的KATP通道（mitoKATP）。分子细胞学研究表明:sarcKATP通道由中心的四个内向整流钾通道（Kir6.x）和外围的四个硫脲类受体(SUR)亚单位形成四聚体的复合体结构[20，21]。内向整流钾通道主要有两种：即Kir6.1（相对分子量为49000D）,和Kir6.2，它们的主要结构有着高度的同源性(69%的核苷酸序列和72%的氨基酸序列相同); SUR主要有三种，即SUR1、SUR2A和SUR2B。Kir6.x形成孔道结构，而SUR调节KATP通道对ATP、腺苷、通道激动剂以及阻滞剂的敏感性[22]。钾通道的活性只受细胞内ATP浓度的调节[23,24]，ATP对其抑制的最大半数受抑（IC50）约为10µmol/L，KATP通道开始被抑制，正常胞浆内的ATP浓度却高达毫摩尔级为5-10mmol/L,KATP 几乎完全被抑制,细胞内ATP与细胞内相应结合位点结合抑制KATP通道，细胞外ATP不起作用。细胞内ATP浓度下降、酸中毒、乳酸、二磷酸核苷（如ADP和GDP）均可使KATP通道开放，如心肌缺血时。部分被ATP抑制的通道在Mg2+存在时可被ADP激活。KATP通道的内源性调节（受G-蛋白的调控）[25] ：腺苷、乙酰胆碱、肾上腺素、缓激肽、阿片等可通过G-蛋白相关机理而促使KATP通道的开放。KATP通道的外源性调节（药理调节）：钾通道开放剂能降低KATP通道对ATP敏感性，在细胞内高浓度ATP的情况下，激活钾通道，促使钾通道开放。磺脲类药物能抑制KATP通道，磺脲类药物如格列苯脲（Glibenclamide、Gli）等能高度选择性抑制各类细胞膜上的KATP通道。钾通道开放剂可降低KATP通道对ATP的敏感性，表现为ATP抑制K ATP通道的Ki值发生位移，致使ＫATP在较高浓度才有抑制作用，但不改变剂量效应曲线的斜率。这种竞争性抑制提示ＫATP通道开放剂和细胞内ATP作用于同一位点。SarcKATP通道虽广泛存在于各种组织中，但其分子结构表达具有组织特异性。如Kir6.2/SUR1形成胰腺β细胞的sarcKATP通道，Kir6.2/SUR2A是心肌的sarcKATP通道[22]，Kir6.1/SUR2A和Kir6.2/SUR2B形成血管平滑肌的sarcKATP通道[26,27]。 4.KATP 通道在心肌的分布 心肌细胞中也存在两种不同的KATP通道,即sarcKATP通道与mitoKATP通道,sarcKATP通道分子结构已被成功地克隆，据报道SUR2A和Kir6.2mRNA在Cos1细胞的重组KATP通道中的联合表达，具有与天然的心肌细胞KATP通道相同的特性[28]，Kir6.x/SUR1敲除鼠的实验中发现,预处理的保护作用不需要该种类型的KATP通道[29], 并且在鼠心脏中，Kir6.1和Kir6.2mRNA都大量表达[30]所以，心肌KATP通道可能是由Kir6.x与SUR2A组成。mitoKATP通道在一些细胞和脂双分子层的中虽具有特殊的药理学特性，但至今分子结构还不清楚， Liu等通过转染HEK293细胞技术，并比较不同的KATP通道亚单位组成结构与天然的心肌mitoKATP通道的药理学特性，惊奇地发现：mitoKAtP通道与Kir6.1/SUR1组成的KATP通道的药理学特性非常类似[31]，尽管这不足以证明mitoKATP通道的结构就是由Kir6.1/SUR1组成，且最近一些研究对该通道的存在提出了一些争议[32，33]，但还是为我们进一步探索mitoKATP通道的具体分子结构提供了有用的线索。 5.SarcKATP 通道在IPC中的作用 继Noma发现心肌中存在KATP通道以来，Cole等首次证实一种非选择性的KATP通道阻滞剂格列苯脲通过阻止APD的缩短，而废除了再灌注期心室功能的恢复，KATP通道开放剂吡那地尔通过缩短APD而加强了再灌注期心室功能的恢复[34]。此外，Tan等证实IPC或KATP通道开放剂都能缩短APD的时程[35]。Yao和Gross发现IPC能导致狗心脏APD的缩短，并能被格列苯脲阻滞[36]，KATP通道开放剂bimakalim通过缩短APD而降低了IPC的阈值[15]。Schulz等也发现IPC使猪心APD缩短，并减少了猪心的梗死面积[37]，最近，他又证实二氮嗪对Kir6.2敲除鼠心的收缩功能的恢复没有保护作用，而对WT鼠心产生了保护作用，并伴有APD的缩短[38]，这种保护作用能被HMR-1098(一种特有sarcKATP通道阻滞剂)而不能被5-HD阻断。以上这些实验都有力支持sarcKATP通道在鼠的IPC中起了极其重要的作用。sarcKATP通道的阻滞废除了IPC对兔离体心肌的保护[39]，说明sarcKATP通道在多种动物中同样有保护作用。但对此理论仍然存在一些争议。正如Schulz等提出：sarcKATP通道的作用可能由于鼠科这样高心率动物的原因而被夸大[38]。Rajashree等也证实IPC对Kir6.2亚单位突变株的转基因鼠没有保护作用[40]，但他使用的是心脏离体灌注模型，并以缺血后心脏收缩功能的恢复而不是以梗死面积作为恒定指标。因为在离体心脏模型中，心肌顿抑程度和梗死面积之间没有可靠的线性关系[41]，所以有可能遗漏了IPC对这种转基因鼠心肌梗死面积的保护。 SarcKATP通道是通过什么信号传导通路又是如何保护心肌的还不清楚。Liu[42]等在离体兔心室肌模型中发现，腺苷和PKC的激活增加了KATP通道的电流，该作用能被非选择性的腺苷受体拮抗剂8-SPT废除。短暂的缺血刺激可导致腺苷浓度增加，并激活腺苷A1和A2受体[43]，所以认为，腺苷增加并激活腺苷受体而触发了sarcKATP通道的开放，或是腺苷受体激活和PKC磷酸化协同作用使sarcKATP通道开放。PKC被认为是IPC中最主要的信号介质。最近Light[44]等证实了PKC和sarcKATP通道在功能上的耦合，PKC激活或迁移可能是sarcKATP通道的上游事件。 SarcKATP通道心肌保护可能存在另一个机制，即经特有的通道诱导的细胞内信号传导机制。SarcKATP通道被激活后产生细胞膜的超极化，继而激活了mitoKATP通道。Waring[45]等发现鼠海马区细胞膜超极化后，可使磷脂酶D的活性增加；磷脂酶D与IPC有密切的关系[46]；磷脂酶D产生甘油二脂使PKC激活或转位，从而又开放了sarcKATP或mitoKATP通道。6.mitoKATP 通道在IPC中的作用 最初认为是sarcKATP通道的开放，导致K+内流入细胞，使APD缩短，钙内流减少，从而抑制细胞内钙超载，参与了IPC的心肌保护机制。1994年，Yao和Gross首次提出sarcKATP通道的激活导致APD缩短不是KATP通道开放产生心肌保护的机制[15]。Garlid[17]在用croakalim和二氮嗪激活KATP通道一半的剂量就激活了mitoKATP通道，心肌mitoKATP通道对二氮嗪的敏感性是sarcKATP通道的2000倍左右[47]， 直接提出了mitoKATP通道可能参与了IPC的保护机制。Sasaki等用一种新药物MCC-134（能开放sarcKATP而阻滞mitoKATP通道）阻止了IPC对兔和鼠心肌的保护作用[48]，所有这些都提示mitoKATP通道或线粒体上的作用位点在IPC和二氮嗪预处理中起了主要作用。而mitoKATP通道阻滞剂能阻断这种保护作用[49]，提示mitoKATP通道参与了IPC的保护作用。最近，有实验发现IP使线粒体摄入K+增加，直接证明了IP中确实有mitoKATP通道的激活[23]。在IP中，mitoKATP通道或线粒体上的作用位点通过何种机制参了心肌保护还不是非常清楚。有人认为可能是通过激酶激活途径和该通道的磷酸化作用参与了IP[1250],mitoKATP通道的活性在IP中有规律性的变化，对该通道的氧化可增加其活性[51]，在IP期间，适量ROS的产生通过氧化作用而直接激活了mitoKATP通道[51]，参与了IPC的保护作用。而ROS的产生也可能是mitoKATP通道激活的下游事件[52，53，54]，所以推测mitoKATP通道在IPC的心肌保护中起着启动物质和终末效应器的双重任务。 mitoKATP通道的激活本身就促进了对心肌缺血的保护，包括阻止过度的线粒体基质的收缩[55，56]，提高线粒体在再灌注期的氧化磷酸化效能[55]，减少缺血期高能磷酸化合物的丢失[57]，阻止线粒体缺血期钙超载[57，58]。 7.sarcKATP通道与mitoKATP通道的联系 在IPC中,是sarcKATP通道还是mitoKATP通道起着更为重要的作用,一直存在争议[8]。sarcKATP和mitoKATP通道均参与了IPC对狗心肌梗死面积的保护[59]，阿片肽诱导的心肌所产生的延迟保护作用中, SarcKATP通道可能起了触发器或终末效应器的作用，推测是阿片肽与线粒体相互作用，调节SarcKATP通道对氧化还原和代谢的敏感性，从而启动了延迟保护的机制[60]。Bernado NL发现：4次反复的缺血5分钟再灌注10分钟，可明显减轻24小时后的兔缺血再灌注心肌梗死面积，该保护作用均能被格列苯脲和5-HD所阻断，说明sarcKATP与mitoKATP通道均参与了IPC的延迟保护作用[61]。所以推测sarcKATP与mitoKATP通道在心肌保护中起着一个互动的作用。 8.KATP通道的线粒体保护机制 8.1 线粒体内钙超载 研究表明导致细胞不可逆损伤的根本原因是线粒体Ca2+超载。Miyamae等观察大鼠离体心脏在缺血再灌注条件下线粒体与胞浆Ca2+浓度的变化后指出：心肌细胞的坏死或复苏与线粒体Ca2+浓度密切相关，而与胞浆Ca2+浓度无关[62]。Miyata等对分离的单个心肌细胞在缺氧复氧条件下进行研究，也得出相同的结论。线粒体高浓度的Ca2+导致MPT发生，线粒体渗透性转换孔永久性开放，它允许分子量高达5000D的物质出入线粒体，使线粒体内容物丧失，膜电位永久消失，水分子大量进入线粒体内，导致线粒体肿胀甚至崩解[63]。一旦线粒体Ca2+积聚超过其所能承受的限度，线粒体渗透性转换（MPT）发生，细胞死亡已属必然，可见线粒体Ca2+严重超载是细胞不可逆损伤的根本原因[64]。Murata 等试验表明缺血和钾通道开放剂预处理能抑制兔离体心肌线粒体钙超载，并推测预处理心肌保护机理与限制再灌注钙超载有关[58]。mitoKATP通道的开放通过调节线粒体内钙超载而发挥了有益的作用。当mitoKATP通道短暂开放时，导致K+净摄入增加从而耗散线粒体内膜电位，使电子传递解耦联，降低Ca2+在线粒体内的积聚，最终阻止线粒体内Ca2+超载[65]。 8.2 线粒体ROS的产生 氧自由基是缺血或缺氧线粒体损害的另一主要原因。线粒体含有丰富的磷脂，尤其是心磷脂(cardiolipin,CL)，它作为线粒体内膜的主要成分，为细胞色素氧化酶及其它某些线粒体蛋白发挥功能所必需。心磷脂具有高度不饱和性，对氧化应激敏感性高，它的过氧化可能导致线粒体细胞色素c氧化酶、F0F1-ATPase的活性降低。同时氧自由基可激活PLA2，降解膜脂质，使线粒体结构受损。蛋白质氧化可由氧自由基直接引起或脂质过氧化间接引发，线粒体呼吸复合体以及腺苷酸转运酶(adenine nucleotide translocase，ANT)等所含的某些重要琉基受到氧自由基的攻击形成二硫键，使这些酶蛋白活力降低甚至丧失。大量试验证明心肌缺血后再灌注早期活性氧的爆发性产生是造成再灌注损伤的主要原因[66-68]。氧自由基不再被认为只是一种缺血再灌注心肌的损害物质，其作为重要的细胞内第二信使，参与IPC的心肌保护作用越来越受到重视。生理情况下,线粒体也在持续地产生小量的ROS,缺血/缺氧后ROS的产生会增加[66]，线粒体呼吸链复合体I和III是ROS产生的主要位点，尤其是III位点，因为此位点产生的ROS远离抗氧化剂系统的清除[4]。再灌注产生的大量的ROS会导致组织的损伤[69]。但在IP中，线粒体产生小剂量的短暂的ROS却能阻止随后更长时间缺血再灌注带来的ROS急剧增加的后果[68]。低浓度的氧自由基能够使兔离体心肌模拟出IPC的保护作用，使心肌梗死面积减少，良好恢复缺血后左心室的功能[70]。ROS通过活性氧诱导的活性氧释放（RIRR）进一步放大对PKC 为中心的信号系统的激活，保持PKC持续转位，激活最终的效应器线粒体钾通道，可能存在ROS和mitoKATP通道之间正反馈机制。 8.3 线粒体电子传递链的阻滞 已有实验证实二氮嗪能有效地抑制线粒体中琥珀酸氧化酶活性[71]，Hanley[72]等发现二氮嗪能剂量依赖性地抑制猪心线粒体中琥珀酸的氧化，但却没有改变NADH的氧化还原反应，而吡那地尔阻滞了NADH链的氧化对琥珀酸链没有影响。并且发现大鼠心脏缺血预处理期间，线粒体NADH链呼吸功能受阻，ROS产生增多，同时mitoKATP通道被激活[23]，从而产生了心肌保护作用。 8.4 线粒体膜电位的变化 通常情况下，线粒体外基质中K+浓度为110mM,线粒体膜电位约等于-180mv，理论上钾通道开放能导致线粒体K+的内流和线粒体膜电位的去极化。但mitoKATP通道的开放与线粒体膜电位去极化之间是否有关一直存在争议[73]。在胰腺β细胞中，格列苯脲不能阻滞二氮嗪对线粒体内膜去极化作用，至少说明在这种类型的细胞中，二氮嗪的膜去极化作用与KATP通道的开放无关[73]；尼卡地尔对肝线粒体膜电位没有影响，而一种新的KATP通道开放剂RP-66471却能使线粒体膜发生去极化。支持KATP通道开放能影响线粒体膜电位的实验认为：钾通道开放剂对线粒体膜电位的影响程度取决于钾离子的电化学梯度；5-HD本身对线粒体膜电位没有影响,却能够阻止钾通道开放剂的线粒体膜电位的去极化作用[74]。线粒体膜电位下降将耗散合成ATP的动力，降低ATP的合成速率，代偿性地加速线粒体呼吸链的传导，增加心肌线粒体氧的消耗[74]。 8.5 线粒体通透性转换孔(mPTP)的变化 mPTP是由线粒体内外膜之间的多种蛋白质组成的复合体结构，包括胞浆侧的己糖激酶、外膜的Porin、膜间隙的肌酸激酶、内膜的腺嘌呤核苷转位酶以及基质侧的环孢霉素A受体等组成。在缺血时，线粒体膜间隙的八聚体结构的肌酸激酶将转变成二聚体的形式，并且发现这种二聚体的肌酸激酶与VDAC和ANT等形成了具有mPTP特性的蛋白质复合体结构[75]。mPTP在再灌注早期就开放，并伴随线粒体基质pH的升高。mPTP开放可导致以下后果：（1）大量质子漏入线粒体基质内，线粒体跨膜质子梯度和跨膜电位耗散，氧化磷酸化解耦联，ATP水解增加；（2）各种离子如钙离子和小分子物质如嘌呤碱和嘧啶碱大量流出基质，进入胞浆；（3）大量的水分子和小于1500Da的物质进入线粒体基质中，导致线粒体基质膨胀，线粒体内膜嵴伸展，外膜破裂；（4）膜间隙的细胞色素C和前凋亡因子释放到胞浆，通过caspase级联反应，引起细胞凋亡或死亡[76]。在预处理期间,mPTP短暂的,以低电导形式的开放介导了大鼠离体灌注心脏的保护，环孢霉素A通过阻滞预处理期间mPTP的开放，而废除了IPC和二氮嗪的这种保护作用[24]。IPC可以提高mPTP对缺血再灌注损伤的抵抗，这种作用能被5-HD所阻断，说明mitoKATP与mPTP之间存在某种联系，可能参与了这种保护作用[25]。 是sarcKATP还是mitoKATP通道的激活都产生了明显的心肌保护作用。MitoKATP通道的激活在早期IPC中起着启动器或终末效应器或两者兼有的作用。MitoKATP通道开放，导致线粒体基质容积适当增加，调节线粒体电子传递链的速度，保护线粒体膜间隙的正常结构，维持缺血期线粒体膜对ADP和ATP的低通透性，从而保证了线粒体与细胞胞浆中能量的有效转移，这或许才是IPC心肌保护的直接原因。SarcKATP通道通过启动mitoKATP通道的开放，或是直接经PKC途径产生了心肌的保护。此外，IPC对Kir6.2缺陷鼠没有保护作用的事实，似乎强调sarcKATP和mitoKATP通道在IPC和KATP通道开放剂的心肌保护中有着互补的作用，他们一起激发了对心肌的保护。 |
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