Effects of Retrograde Cerebral Perfusion of Oxygena ted Red Blood Cell on Brain of Rat after Deep Hypothermia Circulation Arrest

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苏殿三　王祥瑞　郑拥军　赵延华　张挺杰

上海第二医科大学仁济医院麻醉科, 上海　200127

SU Dian-san, WANG Xiang-rui, ZHENG Yong-jun, ZHAO Yan-hua, ZHANG Ting-jie

Department of Anesthesiology, Renji Hospital, S hanghai Second Medical University, Shanghai　200127, China

Abstract

Objective：To observe the effects of retrograde cerebral perfusion of oxygenated red blood cells on therat brain after deep hypothermic circulation arrest.

Methods：Thirty-six SD rats were divided into three groups:sham operation group(shamop,n=12),deep hypothermic circulation arrest alone group (DHCA,n=12) andretrograde cerebral perfusion of oxygenated red blood cells group (DHCArcp,n=12). After set up of the model of DHCA (18℃,90min)the brainswere dissected and the pathological changeswere examined by the light microscope and electron microscope, the wet/dry ratio of the brain was recorded at the same time.

Results：Light microscopy and electron microscopy revealed that the injury of brain in DHCA rcp group was less than DHCA group, but the wet/dry ratio of the brain had significant difference between the groups.

Conclusion： Retrograde cerebral perfusion of oxygenated red blood cells does have protective effect and does not result in brain edema after DHCA.

Key words: Deep hypothermia circulation arrest; Retrograde cerebral perfusion; Brain; Rat

　　虽然深低温停循环技术(deep hypothermia circu-lation arrest,DHCA)已广泛应用于大血管和脑动脉瘤等手术, 但其术后的神经并发症仍然在18%左右^[1,2]。本文通过对DHCA后鼠脑形态学变化的观察，研究逆行灌注氧合浓缩红细胞的脑保护效应。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

材料与方法

动物分组　成年健康雄性SD 大鼠36只，体重400～450g，由中科院上海动物中心提供，生产许可证号为SCXK(沪)2003-0003。随机分成3组：假手术对照组(Shamop组)、单纯深低温停循环组(DHCA组)和逆行灌注浓缩红细胞组(DHCArcp组)，每组12只。

氧合浓缩红细胞的制备　大鼠腹腔注射混合麻醉药2.4mL/kg(芬太尼0.005%、氯氨酮5%和氟哌利多0.25%)诱导麻醉后，股动脉穿刺，抽取全血15～20mL，预先在注射器中加入足量的肝素(100IU) 。将全血转移到离心管中离心，4℃，5,000×g，7min，然后吸去上面的血浆，收集离心管下层的液体即为浓缩红细胞，测定HCT为70%～75%，4℃保存。使用前将上述制备的浓缩红细胞用注射器轻轻的打入通有氧气的模式氧合器中充分氧合。

动物模型的制作

1. 体外循环的构成和监测：体外循环环路由20^#压力注射管连接储血器(10mL注射器)、血泵(兰格蠕动泵BT00-100M /YZ1515)和氧合变温器(中空纤维膜式氧合器，氧合面积为0.1m² ，变温面积0.03m²，预充量为8mL，上海复旦大学生物材料有限公司提供)组成。预充液总量为20mL(氧合器8mL，储血器8mL，其余管道4mL)。预充液为乳酸林格氏液10mL、20%甘露醇1mL、肝素1mL(100IU)、6%贺斯8 mL；连续测量动物直肠温度、心电图、心率、平均动脉压，血气分析仪测定股动脉血氧分压、pH值、红细胞压积、颈静脉血氧饱和度和血乳酸。

2.动物模型的制作过程：术前20min肌肉注射阿托品0.03mg/kg。腹腔注射混合麻醉药2.4mL/kg(同上)，诱导并行气管插管，麻醉仍以该复合液维持。插管后的大鼠实行机械通气，呼吸频率为60次/min，潮气量为8mL/kg。分离并穿刺双侧股动脉，一侧连接动脉测压系统，另一侧用于动脉灌注。分离并穿刺右侧颈内静脉，以监测颈内静脉的血气。分离右侧颈静脉，以末端带有侧孔的14G静脉留置针穿刺(深度为3.5cm左右)，使头端到达右心房水平。穿刺成功后立即开始体外循环转流。转流开始时灌注流量为10mL/min, 将灌注流量逐渐加大到约50mL/min，转流开始后停止机械通气调节变温水箱的温度，20min内将大鼠的体温降到18℃，停止体外循环，血液经短路直接转流至储血器内。DHCArcp组在停循环的即刻经颈内静脉插管逆行灌注氧合浓缩红细胞5 mL。停循环时间为90min，依靠体表降温维持深低温状态。然后在30min内复温至36℃～37℃，停体外循环，恢复机械通气。保持循环呼吸稳定60min视为成功。假手术对照组仅作各种插管，不进行体外转流。模型建立成功后，每组动物都分成两部分。一部分进行形态学检查，立即开胸升主动脉灌注生理盐水和4%的多聚甲醛，灌注固定结束后将脑组织沿中线分成左右两半脑，左侧进行病理学检查, 右侧的4个半脑进行电镜检测CA1区的超微结构变化。另外一部分动物迅速断头取脑称取湿重，并立即置入烘干箱内烘干至重量不再减轻，测得干重，并计算湿重与干重的比值。

病理学检查　取固定在多聚甲醛中的标本，参考图谱在鼠脑的腹侧面以视交叉为标志，在视交叉处作冠状切面，在视交叉向尾侧50mm处再作一切面，然后行常规石蜡包埋、切片和HE染色。HE染色结果应用Leica DMBL图像分析系统进行分析，在109634像素的固定区域计数海马CA1区、皮层和丘脑三个脑区变性坏死细胞的个数。

透射电镜检测　取大鼠海马CA1区脑组织。常规固定、脱水、置换、浸透、包埋后以枸橼铅染色液片染，应用HITACHIH-500 透射电镜观察超微结构。应用FLameng等线粒体半定量法对线粒体评价记分。按此法将线粒体分成0～4五个等级。将每个电镜标本随机选取5个视野，以相同的放大倍数进行摄片，每张照片计数10个线粒体，将10个线粒体的评分相加得出总分，然后将5张照片的分数进行平均，得出每例标本的分数。线粒体的分级方法为：0级为线粒体结构正常，充满颗粒；1级结构正常，颗粒缺乏；2级为线粒体肿胀，基质透明；3级为线粒体嵴分裂，伴基质透明或浓集；4级线粒体嵴分裂，伴线粒体内膜和外膜完整性缺失。

统计学处理　应SPSS10.0软件进行统计，数据用表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为有统计学差异。

结　果<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

血气监测结果　从术中监测的各项指标的结果看，本模型基本稳定。各项指标的变化和临床的情况接近，主要表现为复温复灌开始时的酸中毒。两实验组的pH值在复温复灌开始时均明显下降，但是单纯DHCA组下降比较明显，DHCArcp 组下降较缓和(P<0.05)。血乳酸浓度的变化也反映了这一趋势，即单纯DHCA组血乳酸的浓度较高，而DHCArcp组较低(P<0.05)。其它血气监测指标在两实验组之间未见明显差异(P>0.05) (表1) 。

病理检测结果　HE染色结果发现，两实验组在海马CA1区、皮层和丘脑均可观察到数量不等的变性坏死的神经元，这些神经元主要表现为细胞核浓染、变性、形态多种多样, 细胞浆减少或者消失(图1) 。图像分析结果显示,在海马CA1区和皮层DHCArcp组与单纯DHCA组相比，单位面积内变性坏死的神经元数量明显变少(P<0.05)；但是丘脑的情况比较特殊，两实验组之间没有明显差异(表2) 。

超微结构的变化　对照组神经元细胞核类圆形，核膜境界清楚，核仁清晰，异染色质保持神经元特点，胞质丰富，有多数多聚核糖体，粗面内质网丰富，池较狭窄，可见少量不规则分布的神经微丝。线粒体形态结构正常。单纯DHCA组海马神经元细胞核核膜皱缩，形状不规则，在局部出现凹陷。胞浆有局灶性胞浆大溶解区，细胞器缺乏，有的细胞器消失殆尽，代之以泡状结构。线粒体中等程度肿胀，嵴断裂或者消失，在线粒体外膜仍然有少量颗粒存在，外膜完整，线粒体分级多属于2～3级(图2A)。DHCArcp组海马神经元细胞核膜有皱缩现象，核膜不规则，但局部的核膜内陷程度较轻。胞浆没有明显的肿胀，各种细胞器丰富，未发现局灶性胞浆大溶解区。线粒体仅表现为轻度肿胀，嵴部分断裂，颗粒减少，线粒体分级多属于1～2 级(图2b)。另外在所有实验组和对照组海马神经元突起内的线粒体均没有明显改变，线粒体分级多为1～2级。线粒体半定量结果显示，单纯DHCA组的评分比DHCArcp组高，线粒体损伤最严重(表3) 。

脑组织含水量的变化　本实验结果表明，大鼠进行DHCA后均有脑水肿存在，表现为脑组织的湿/干比明显增加(P<0.05)，但是在两实验组之间脑水肿的程度没有明显差异(P>0.05) (表3) 。

讨　论<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

虽然近年来DHCA 技术不断成熟，临床应用的范围也不断扩大，但是如何减少术后的神经并发症一直是学者们关心的问题。Sakamoto 等^[3]认为，DHCA术后的神经并发症与术中的HCT值有关，HCT在30%时比20%术后的神经功能评分高，病理损伤小。Toshiharu等^[4]的研究也得到了同样的结论。Lennart等^[5]应用荧光显微镜直接观察脑组织的微循环发现，HCT在30%时微循环内的血流量并没有减少，从而证明，较高的HCT值对DHCA患者有利。分析其原因可能是在DHCA 情况下，血液稀释时的一些代偿机制已经不存在了。血液稀释时，虽然动脉血氧含量减少，但是随着代偿性心排量增加，血流速度增加，仍然能够保证和改善组织的氧供。在DHCA期间，心脏和体外循环机均停止工作,靠心输出量增加来提高氧供已经不可能，况且即使在停循环之前，影响体外转流量的因素很多，一般并不能根据血液稀释的程度自动调节。循环停止后，脑组织代谢所需要的氧只能来自血液中的氧储备。而血液中氧储备主要是红细胞结合的氧。所以从这个角度出发，相对较高的红细胞压积就能够增加血液中的氧储备，提高安全时限，减少术后的脑损伤。正是基于这一理论，我们假设在停循环期间逆行灌注氧合的浓缩红细胞同样能够增加血液中的氧储备，具有脑保护作用。实验结果证明我们的假设是正确的。逆行灌注氧合的浓缩红细胞确实具有脑保护作用，不论是普通病理还是电镜超微结构观察都证明了这一点。

与临床上应用的持续逆行灌注技术一样，本研究应用的逆行灌注氧合浓缩红细胞同样存在着是否加重脑水含量的问题^[6]。实验结果排除了这种疑虑，因为我们并没有看到逆行灌注氧合浓缩红细胞后脑水含量比单纯DHCA组增加的证据，因此我们认为，在停循环期间逆行灌注氧合浓缩红细胞的脑保护作用是确切的，并且不会增加脑水含量。

参考文献

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2.    BellingerDC, Jonas RA, Rappaport LA, et al. Developmental andneurologic status of children after heart surgerywith hypothermic cir-culatory arrest or low-flow cardiopulmonary bypass[J]. N Engl J Med, 1995, 332: 549-555.

3.    Sakamoto T, ZurakowskiD, Duebener LF, et al. Combination of alpha-stat strategy and hemodilution exacerbates neurologic injury in a survival p iglet model with deep hypothermic circulatory arrest[J]. Ann Thorac Surg, 2002, 73: 180-189.

4.    Toshiharu S, Dominique S, Peter C, et al. Effects of oncotic p res-sure and hematocrit on outcome after hypothermic circulatory arrest[J]. The Annals of Thoracic Surgery, 1998, 65: 155-164.

5.    Lennart F, Takahiko S, Shin2ichi H, et al. Effects of hematocrit oncerebral microcirculation and tissue oxygenation during deep hypot-hermic bypass[J]. Circulation, 2001, 104 (12Suppl1): I260-I264.

6.    Reich DL, Uysal S. Con: Retrograde cerebral perfusion is not an op timal method of neurop rotection in thoracic aortic surgery[J]. J Cardiothorac Vasc Anesth, 2003, 17: 768-769.