董振明 任建军 The effects of propof ol on the caspase casca de reaction induced by caspase-12 in myocardial ischemia-reperfusion injury DONG Zhenming, REN Jianjun. Department of Anesthesiology, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000
【Abstract 】 Objective To investigate the effect of propofol on the caspase-12 in ischemia-reperfusion myocardium, to elucidate the protective mechanism of propofol on myocardial tissue underwent ischemia2reperfusion in rabbit heart. Methods Twenty-four healthy male white rabbits( 4 months of age) weighting 2.1～2.3kg were randomly divided into sham operation group, ischemia-reperfusion group and propofol group. The rabbits were anesthetized with 3 % pentobarbital 30mg/kg, to make the model of ischemia-2reperfusion injury according to the referent literatures. The propofol (2.5mg?kg-1?h-1) was infused through the vein at the edge of ear, then infusing it at the dose of 5 mg?kg-1?h-1 continuesly to the end of experiment. The tissues of ischemia-reperfusion region were taken to detect the expression of caspase-12, caspase-3 by immunohistochemistry and to analyze them with Motic 6.0 image analysis system, and to detect the I/R myocardial apoptosis by flow cytometry and TUNEL staining methods. Results The caspase-12 and caspase-3 expresses in a low level, a few apoptotic cells were detected by FCM and the TUNEL staining in sham operation group . As compared with that in sham operation group, the expression of caspase-12 and caspase-3 in I/R group and propofol group were higher (P<0.05)； the apoptotic cells detected by FCM and TUNNEL methods were significantly increased, as compared with those of sham operation group(P<0.05). As compared with those of I/R group, the levels of caspase-12 and caspase-3 in propofol group were lower than that of I/R group, the percentage of apoptotic cells was lower than that of I/R group(P<0.05). Conclusion Propofol can decrease the number of apoptotic cells of the ischemia-reperfusion myocardium, inhibit the caspase cascade reaction induced by caspase-12, which is one of the protective mechanisms of propofol .
【 Key words】 propofol; myocardical ischemia-reperfusion injury; caspase-12; apoptosis
凋亡在心肌缺血/再灌注损伤中起关键作用，近年来研究表明，半胱天冬酶-12(caspase-12)介导的内质网应激反应性凋亡途径亦参与了缺血/再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡[1,2]。异丙酚通过多种机制减少缺血/再灌注后心肌细胞凋亡[3,5]。但是异丙酚是否能够抑制缺血/再灌注损伤心肌细胞中caspase-12介导的caspase级联反应性凋亡途径尚无定论。本研究旨在观察异丙酚对缺血/再灌注损伤心肌细胞中caspase-12的影响，从内质网角度探讨异丙酚减少缺血/再灌注心肌细胞凋亡的作用机制。 1 材料与方法 1.1 材料 异丙酚（批号：CK796，AstraZeneca公司，意大利），鼠抗人caspase-3活性单克隆抗体（编号：0105，SC27148，Promega公司，美国），Caspase-12（编号：1281，SC-12395，Santa Cruz公司，美国），TUNEL试剂盒（ZK28005，北京中杉生物技术有限公司），AnnexinⅤ-PI凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司），DAB显色剂（河北博海生物有限公司惠赠），PBS（北京宝赛生物技术有限公司惠赠），1640培养液（编号：SH30011.01，Hyclone公司，美国）。实验动物由河北医科大学第二医院实验动物中心提供。其他试剂为国产分析纯。 1.2 方法<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /> 1.2.1 实验分组及动物模型制备：健康新西兰雄性大白兔（雄性心脏表面沉积脂肪较少、动脉血管清晰易辩）24只，4月龄，体重2.1～2.3kg，随机分为3组（每组8只）。假手术组（Sham组）：仅穿线，不结扎冠状动脉，观察150min。缺血/再灌注组（I/R组）：心肌缺血30min，再灌注120min；异丙酚组（P组）缺血30min，再灌注120min开胸前通过耳缘静脉给予异丙酚2.5mg/kg，然后以5mg.kg-1.h-1微量泵持续输入维持至再灌注结束；异丙酚给药剂量参考文献[6]，动物模型制备参考文献[7]，术中胸膜破裂者予以剔除，再按照随机原则在相同条件下予以补齐。
1.2.2 检测指标及检测方法：实验结束后，取左心室缺血/再灌注区心肌组织，用免疫组织化学方法检测caspase-12、caspase-3的表达，用Motic6.0图像分析系统进行处理，比较AO值；用FCM及TUNEL染色法缺血/再灌注区心肌细胞凋亡情况。 1.3 石蜡标本的制作 实验结束后取缺血/再灌注区心肌组织，4%多聚甲醛固定24h后，常规石蜡包埋、切片，片厚4μm，每隔1mm连续取2张切片，用于免疫组化染色和细胞凋亡染色。
1.4 Caspase-12、caspase-3活性形式蛋白质水平的表达（免疫组化染色）检测 切片常规脱腊至水，用3%H2O2室温作用10min，经微波修复后，用正常山羊血清进行封闭，依次与一抗（caspase-12、caspase-3多克隆抗体）和生物素化二抗（山羊抗大鼠IgG，博士德公司）反应，滴加SABC复合物（博士德公司）作用后，用DBA显色，苏木素复染，中性树胶封固。光学显微镜下观察，细胞核呈棕黄色染色者为凋亡阳性细胞，阴性对照片用PBS代替一抗，其余步骤相同。在×400倍光镜下每组随机取一张切片，每张切片随机取10个视野测定其AO值，取其均值用于统计学分析。
1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 1.5.1 制备单细胞悬液：试验结束后，快速取出心脏，取左心室缺血/再灌注区心肌组织，剪成约1cm×1cm×1cm大小8～10块组织，置于300目铜网上，网下置一平皿。用眼科小镊子轻轻搓组织块，边搓边用冰1640培养液冲洗，直至将组织搓完为止。所得细胞悬液再用300目铜网过滤。最后收集悬液，以8cm半径，5000r/min离心，沉淀2min，加冰生理盐水洗涤，再次离心沉淀置于冰生理盐水备用。
1.5.2 FCM检测方法参见文献[8]，收集数据以list mode形式储存，采用Cell Quest功能软件分析。 |
1.6 TUNEL法检测细胞凋亡 （1）切片常规脱蜡至水；（2）用蛋白酶K（20μg/ml溶于Tris/HCl中，pH7.4～8.0）室温孵育15～30min；（3）PBS冲洗2次，擦干样品周围的水，滴加50μl的TUNEL反应混合溶液，在湿盒中孵育60min；（4）PBS冲洗3次，擦干样品周围的水分，加入50μl转化剂-POD，在湿盒中37℃孵育30min。PBS冲洗3次，加入50～100μlDAB底物溶液，室温孵育10min，PBS冲洗3次；（5）封片（在封片前可以复染），在光镜下分析结果。对照组经过固定和通透的细胞样品加入50μl缓冲液以代替TUNEL反应混合物，标记步骤以下同上。结果判定：细胞核棕色者为凋亡细胞。用光学显微镜×400观察，随机选择10个阳性视野，计数每个视野中的阳性细胞数，取其平均值作为该组凋亡细胞数。 1.7 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件包，计量资料用 ±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。 <?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /> 2 结果 2.1 Caspase-12、caspase-3免疫组化测定结果 caspase-12、caspase-3在Sham组中均有一定程度的表达。与Sham组比较，I/R组和P组三项指标的AO值升高（P<0.05）；与I/R组比较，P组三项指标的AO值降低（P<0.05）。见表1。 表1 免疫组化检测结果 ±s，n=8  <?xml:namespace prefix = v ns = "urn:schemas-microsoft-com:vml" /> 注： 与Sham组比较, *P<0.05; 与IPR组比较, △P<0.05 2.2 细胞凋亡检测结果 FCM检测结果：Sham组有少量凋亡早期细胞。与Sham组比较，I/R组和P组凋亡早期细胞增加(P<0.05)，与I/R组比较，P组凋亡早期细胞减少(P<0.05)；TUNEL染色Sham组有少量阳性细胞，与Sham组比较，I/R组和P组阳性细胞数增多(P<0.05)，与I/R组比较，P组阳性细胞数减少(P<0.05)。见表2。 表 2 细胞凋亡检测结果 ±s，n=8 组别 | 例数 | FCM(%) | TUNEL | Sham组 | 8 | 0.68±0.05 | 7.1±1.1 | I/R组 | 8 | 31.7±1.5* | 28.2±3.4* | P组 | 8 | 16.0±1.8*△ | 16.3±2.1*△ |
注： 与Sham组比较， *P<0.05; 与IPR组比较， △P<0.05 综上所述，抑制caspase-12介导的caspase级联反应性凋亡途径是异丙酚减少缺血/再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡的机制之一，但其抑制该凋亡途径的具体机制还有待进一步研究。<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /> 参考文献
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