ABSTRACT

Heme oxygenase-1 (HO-1), a kind of antioxidative enzymes, was the rate-limiting enzyme of heme degradation which produces bilirubin, carbon monoxide(CO), and iron. It was expressed at a low level in most mammalian tissues and was highly induced by many factors which may induce oxidative injury such as heme, hydrogen peroxide, ultraviolet radiation, heavy metals, hypoxia, hyperoxia, nitric oxide (NO), shear stress, endotoxin, cytokines and aspirin and protect against oxidative stress. HO-1 could protect people from a lot of diseases and its protective mechanism might be related to various kinds of metabolites. However the exact mechanism still remained unknown. This article reviewed its production, induction, function of HO-1 and the relationship between HO-1 and ischemic brain injured.

Key words: Heme oxygenase-1; Ischemic; Brain; Injured

现已证实HO-1是一种应激蛋白，HO-1在正常情况下低表达或不表达，但在应激状态下HO-1适量表达可以减轻细胞损伤、蛋白质氧化及脂质过氧化，减轻血管紧张素Ⅱ引起的内皮细胞损伤，对血管损伤的修复有潜在保护作用。研究表明，CO诱导HO-1活性增强可减轻内皮细胞的氧化损伤和凋亡，降低培养的内皮细胞对H₂O₂造成的氧化性损伤的敏感性，血红素诱导的HO-1活性增加可减少过氧亚硝基引起的主动脉内皮细胞的凋亡^[2]，HO-1的体内外诱导均能提供抗氧化应激的保护作用，Grosse等^[3]在培养的人内皮细胞研究中发现，L丙氨酸( L-alanine)可使HO-1活性增加，并降低H₂O₂的细胞毒性作用。氧自由基形成的动物模型研究表明^[4] 在大鼠冠脉缺血/再灌注模型中，将SD大鼠全身预热15min(肛温42℃) ，实验前室温恢复24h，再行冠状动脉阻塞45min后开放冠状动脉再灌注3h，以心肌梗死大小和血清肌酸激酶活性评估心肌损伤的程度，测定心肌组织中HO-lmRNA和蛋白质的表达。热预处理组减少再灌注时心肌梗死的面积和肌酸激酶释放，该作用被ZnPP-IX( HO抑制剂)和亚甲蓝安全阻断，热应激增加HO-l mRNA 和蛋白质表达，但该作用不被亚甲蓝阻断^[5]。

2. HO-1基因的诱导产生、表达调节及信号传导

2.1 诱导HO-1表达的分子调节机制十分复杂。目前已经确定HO-1的编码基因定位于人染色体22q12，含5个外显子，长约14 kb，研究发现，人HO-1基因启动区所特有的(GT)n微卫星结构的长度直接影响HO-1基因的转录水平，(GT)n越长，即GT二核苷酸序列重复数越多，HO-1 基因转录和表达的水平就越低。体外实验表明HO-1基因启动子微卫星影响HO-1的转录，在同等程度的氧化应激作用下，GT重复<25次者，HO-1基因转录增加；而GT重复≥29 次者，则转录水平增加不明显，因此GT 重复次数可间接反映人体内HO－1的表达水平，由此可见，HO-1的表达可以在转录水平和蛋白水平调控。

HO-1的诱导产生HO在人多数组织内呈低水平表达可被多种伤害性刺激诱导产生高水平的表达在神经和肝脏和脾脏表达最高^[6]。这些诱导剂包括血红素，高氧、缺氧、热体克、内毒素、过氧化氢、细胞因子、紫外线、重金属和NO等，这些诱导剂的共同特征是可以产生氧化应激。目前有关NO对HO-1的诱导产生研究最多，多数的文献报道指出NO作为一种经典的信号分子能够调节HO-1基因的表达。但也有相反的报道显示HO-1的产生为NO非依赖性的^{[7 8]}。这可能与其研究的模型和组织不同NO的转录不同有关，其具体的机制有待于一步研究。

2.2  HO-1基因表达的调节，目前的研究表明，HO-1基因表达的调控主要发生在转录水平HO-1基因含有4个内含子和5个外显子，在HO-1基因5^，非转录区(UTR)即基因启动子区包含一些增强子和调节片段，包括激活蛋白-1结合位点、金属反应片段、抗氧化反应片段、热体克和血红素反应片段、肿瘤基因杂二聚体结合位点、GC box (Spl)结合位点，转录因子如氧化应激反应转录因子NF-κB和AP-1等与这些特殊位点结合可导致HO-1基因激活。转录因子AP-1是一个对氧化还原敏感的转录因子，可以激活许多基因包括HO-1的表达参与氧化应激的保护性反应AP-1在调节HO-1基因转录中的作用最近才被研究证实，NF-E2相关因子2( Nrf2)尤其重要在对Nrf2基因缺陷的巨噬细胞研究中发现，转录因子Nrf2可与相关基因抗氧化反应成分相互作用，从而调节相关基因表达，在氧化应激诱导的细胞反应中起重要作用^[9]。小鼠HO基因的增强子区域有一个10bp的序列，对于除缺氧以外的各种因子诱导的HO基因表达十分必要，这一序列被称为应激反应成分(StRE)小鼠StRE区域包含有转录因子AP- 1家族或转录因子的结合区，StRE中AP-1结合区域基因突变将导致HO基因表达失活，不受重金属、过氧化氢及LP5等的刺激，显示了AP-1蛋白在HO-1基因表达调控中的作用。此外还有HO基因DNA结合部位包括低氧介导因子-1(HIF-1)和介素6(IL-6)反应成分。HIF是氧敏感基因的转录激话因子可结合小鼠HO-1基因的缺氧反应成分。缺氧反应成分的突变将导致HIF-1结合的失败从而导致缺氧依赖性HO基因表达的失话，表明激动子HIF-1参与缺氧诱导的HO基因表达。IL-6是已知的激话HO基因转录的细胞因子中的一种。研究证实HO-1基因5^，端的基因序列为IL-6的结合反应区域。

2.3  HO-1和信号转导MAP激活酶（有丝分裂原激活蛋白激酶）是细胞外刺激通过激活转录因子调节基因表达的信号传导系统的重要激酶。据报道，有三种MAP激酶亚家族：细胞外信调节激酶(ERK)， c-jun N末端激酶( JNK)和p38家族。ERK可被有丝分裂原激活参与细胞生长和增殖的调节，另外两种激酶与细胞内应激信号有关，因此又被称为应激激活的蛋白激酶。这几种激酶的作用底物及其激动因子有很大的重叠。由于MAP激酶和HO-1均可被应激性刺激激活，并且磷酸化参与了HO-1基因的诱导产生。因此很容易理解MAP激酶信号转导途径参与了HO-1基因的表达。在通过应用ERK和p38通路的化学性阻断剂实验研究，报道ERK和p38通路组分的持续激活可导致HO-1基因表达增加。Furst R等^[10]研究发现在培养的人脐静脉内皮细胞，水杨酸盐可以通过激活JNK/AP-1通路上调HO-1基因的表达。另有证据表明MAP激酶途径也参与了HO反应产物的激活。CO作为HO-1分解血红素的一种产物，具有细胞保护、抗凋亡作用，是通过MAP途径尤其是p38途径所介导的^[11]。

3. HO-1与缺血性脑损伤研究现状

缺血性脑损伤是一复杂的病理生理过程，近年来认识到在缺血性损伤过程中除缺氧和能量代谢衰竭外，由缺血诱导的一系列瀑布样效应是导致缺血性神经元死亡的重要机制。脑缺血后大部分的血管能自然再通或经溶栓、血管重建术等治疗使局部脑血流恢复再通，但这种脑缺血后的再灌注，同时也可加重缺血细胞的损伤，甚至导致细胞的死亡即再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤给脑组织以第二次打击，氧自由基、钙超载、白细胞浸润、一氧化氮和细胞凋亡等通过各种途径参与脑缺血及缺血再灌注损伤。

3.1 HO-1的抗氧化作用　

脑缺血后，大量氧自由基生成，使脑内脂质过氧化作用加强，导致细胞膜及血脑屏障损害，引起和加重缺血脑组织水肿，因此氧自由基的毒性作用已成为脑缺血性损伤的关键性病理环节之一。传统观念认为，胆红素是人体内的一种有害物质。HO-1作用于血红素产生的代谢产物胆绿素、胆红素可以抑制自由基的连锁反应，有很强的抗氧化作用^[12]，这对脑缺血再灌注所产生的大量自由基恰好起到拮抗作用。在生理性氧浓度下，胆绿素和胆红素可阻止多不饱和脂肪酸氧化，其作用与维生素E相似。另外, HO-1能催化血红素分解的Fe²⁺，是脂质过氧化的高效催化剂，能调节铁蛋白和铁储存蛋白表达。铁蛋白与游离铁结合后可减少自由态铁的含量，从而减弱铁的氧化毒性。HO-1的诱导常伴有铁蛋白合成的增加，铁蛋白也为抗氧化剂。将HO-1基因用逆转录病毒载体转染细胞后，其HO-1的蛋白表达量及酶活性均有升高，对血红素和其他氧化剂暴露的抗损伤能力亦见增强^[13] Chen等^[14]报道在控制神经元特异性烯醇化酶的情况下从过度表达HO-1的纯合子转基因小鼠和非转基因同窝小鼠中分离出小脑颗粒神经元( cerebellargranularneuron, CGN)，与非转基因小鼠相比，转基因小鼠CGN的HO-1 mRNA和蛋白表达明显增加，细胞内钙离子浓度降低，谷氨酸介导氧化应激时HO-1的转录反应减弱,存活细胞数量显著增加并证明当HO-1水平增高时，静息细胞内钙离子浓度降低，氧自由基产生速度下降。提示HO-1对神经元氧化损伤有保护作用。

3.2 HO-1对NF-кβ及细胞因子的影响

重型颅脑损伤患者，创伤的应激反应、出血、缺氧等因素，可引起机体剧烈的炎症反应，激活中性粒细胞、单核巨噬细胞等产生多种炎症介质，NF-кβ是DNA结合蛋白，是重要的转录因子。NF-кβ激活后能使多种细胞因子大量表达，因此在各种细胞外刺激介导的细胞信息的转导调控中起中心作用。当细胞受到早期反应细胞因子TNF-a、IL-1β和LPS刺激时，激活细胞内信号通道、胞内信号识别和蛋白水解，使得细胞核局部信息暴露，激活NF-кβ。活化的NF-кβ与位于基因启动子和增强子的кβ序列位点发生特异性的结合。参与众多与免疫和炎症反应有关的基因的转录调控，在一系列的由细胞因子、炎症介质及蛋白酶类参与缺血性脑损伤的发病过程中发挥重要的作用。各种原因引起缺血性脑损伤均有大量细胞因子产生，如TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8等，这些细胞因子引起一系列的炎症级链反应，参与脑损伤过程。HO-1的表达可直接或间接地抑制炎症连锁反应。缺血再灌注时，白细胞在微血管内聚集、粘附，并释放氧自由基和炎性介质等，激活蛋白水解酶导致组织损伤及炎症反应。而微血管内皮细胞中的HO-1过表达能减轻氧化损伤和白细胞粘附。Otterbein等^[15]报道,低浓度(2.5×10^-4)的CO能在体外和体内选择性地下调脂多糖诱导的前炎性细胞因子(TNF-α和IL-1-β),而增加IL-10的表达。Soares等^[16]研究了HO-1氧化产物CO抑制内皮细胞凋亡的分子机制，结果表明CO的抗凋亡效应是通过p38MAPK信号转导途径，NF-κB,以及NF-κB依赖的抗凋亡基因亚群的表达而介导的。Choi等^[17]的研究表明JurkatT细胞过表达HO-1可抵抗Fas介导的凋亡是通过NF-κB的激活而介导的。

3.3 HO-1对 NO及合成酶的影响

 NOS有3种亚型：nNOS和eNOS为结构性表达，仅产生少量NO；iNOS为诱导性表达，在许多细胞类型中被细胞因子，如TNF-a或INF-r等诱导，产生大量的NO。由NO介导的神经酰胺可激活凋亡信号途径，过量NO还可与超氧化物相互作用，产生过亚硝酸盐，而后者是组织损伤中强有力的氧化剂^[18]。HO对NOS系统的调节可以发生在多个水平，①NOS是一个血红素类蛋白，其激活位点需要两个亚铁血红素分子，HO活性的诱导可能加速亚铁血红素降解，从而使NOS的合成原料减少；②HO产生的内源性CO能够与NOS结合，并使该分子失活，神经和巨噬细胞存在的NOS已经被确定能结合内源性CO；③由亚铁血红素降解过程中释放的铁离子通过抑制NOS的核转录能进一步抑制NOS的产生；④HO系统和NOS系统都需要NADPH作为共同的辅因子，而且胆绿素被还原成胆红素也需要NADPH，这种对电子的竞争作用也会进一步影响NOS的活性。符荣等^[19]用局灶性脑缺血模型通过改变HO活性对内源性CO和NO在脑缺血中的作用及相互关系进行了研究。结果表明,在脑缺血后24 h，使用HO抑制剂ZnPP能使CO浓度下降，NO浓度增高，缺血脑组织含水量增加，血脑屏障通透性增加，然而，当同时使用ZnPP和HO诱导剂氯高铁血红素时，CO浓度不变，NO浓度增高，脑含水量和血脑屏障通透性降低，说明在排除CO浓度的影响后NO具有脑保护作用，同时也提示CO在NO神经保护作用中也起着非常复杂的作用。

3.4 HO-1抗细胞凋亡

Nomura发现短暂局灶性前脑缺血后,大鼠海马CA1区的锥体细胞表现为染色体浓集、核断裂,相应区域出现TUNEL染色阳性细胞。近年来发现,缺血再灌注损伤与细胞凋亡有密切的联系,细胞凋亡可能在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。大量的证据显示,HO-1过表达对脑缺血再灌注的保护作用伴有凋亡的降低。Amy等在研究运动神经元和胶质细胞NO抵抗诱导的基因表达机制时发现NO抵抗与HO-1的产生有关并发现一个有趣的现象，HO-1缺乏细胞即使在没有受到NO刺激时发生细胞凋亡的比率亦大大高于HO-1表达的运动神经元和胶质细胞^[20]。Inguaggiato^[21]等发现在HO-1基因表达上调的细胞中p21mRNA和蛋白量明显加,p21可抵御不同的促凋亡刺激。它能与细胞周期蛋白依赖激酶结合并抑制其活性，使细胞周期停滞在G1期。周水秀^[22]等研究发现通过诱导HO-1的表达可减少MCAO局灶性脑缺血-再灌注导致的神经细胞凋亡。

4. 问题与展望

综上所述，HO-1作为一种有催化活性的应激蛋白有着广泛的生物学活性，机体处于氧化应激状态时，HO-1高效表达，保护机体免受损伤。所以，HO-1在氧化应激中的作用值得进一步研究。随着研究的不断深入，HO-1的作用机制日渐明朗，将可能开辟一个新的药物研究领域，动物实验结果显示HO-1基因转染在脑卒中的治疗前景。腺病毒载体介导的人HO-1基因结构可通过大鼠血脑屏障，导致在脑组织中表达，这表明可给予人HO-1基因到中枢神经系统，酶活性短暂过度表达可提供治疗或其他试验之用。若方法适当，有可能从基因水平对缺血性脑损伤的防治提供临床应用策略。

参考文献

1.    Farombi EO, Surh YJ. Heme oxygenase-1 as a potential therapeutic target for hepatoprotection. J. Biochem Mol Biol, 2006, 39(5): 479-491.

2.    Foresti R, Sarathchandra P, Clark JE, et al. Peroxynitrite induces haem oxygenase-1 in vascular endothelial cells: a link to apoptosis[J]. Biochem J, 1999, 339 (Pt3):729-736.

3.    Grosser N, herle S, Berndt G, et al. Antioxidant action of L-alanine: heme oxygenase-1 and ferritin as possible mediators [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 314 (2):351-355.

4.    Yamaguchi T, Terakado M, Hono F, et al. Role of bilirubin as an antioxidant man ischemia-reperfusion of rat liver and induc non of heme oxygenase[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 223 (1): 129-135.

5.    Lu R, Peng J, Xiao L, et al. Heme oxygenase-1 pathway is involved in delayed protection induced by heat stress cardiac ischemia-reperfusion injury[J]. Int J Cardiol, 2002, 82: 133-136. 

6.    Kukoba TV, Moihenko OO, et al. Heme oxygenasc and carbon monoxide: the protection or injury of cells. Fiziol Zh, 2002, 48(5): 79-92

7.    Immenschuh S, Tam M, Ramadori G, et al. Nitric oxide mediates the lipopolysaccharide dependent upregulation of the heme oxygene expressien in cultured rat kupffer cells J. Hepatel, 1999, 30 (1):61-69

8.    Sang Wook Kim, Hyun-Mee Oh, Bcom-Su Kim, et al. Soluble factor from tumor cells induccs hemc oxygenas-1 by a nitric oxide-independent mechanism in murine peritoneal macrophages [J]. Exp, Mol. Med.Vol, 2003, 35(1):53-59    

9.    Ishii T, Itoh K, Sato H, et al. Oxidative stress inducible proteins in macroghes[J]. Free Rad Res, 1999, 31(4): 351-355.

10. Furst R, Blumenthal SB. Nuclear factor-kappa B-independent anti-inflammatory action of salicylate in human endothelial cells: induction of heme oxygenase-1 by the c-jun N-terminal kinase/activator protein-1 pathway J. Pharmacol Exp Ther, 2006, 318(1): 389-394.

11. Brouard S,  Otterbcin LE, Anrather J, et al. Carbon monoxide generated by heme oxygenasc-1 suppress endothclial cell apoptosis[J]. J Exp med, 2000, 192(7): 1015-1025.

12. Abraham NG,KappasA. Heme oxygenase and the cardiovascular-renal system[J].Free Radic BiolMed, 2005, 39(1): 1-3.

13. LimingYang, ShuoQuan, NaderG, et a.l. RetrovirusmediatedHO gene transfer into endothelial cells protects against oxidant induced injury[J].Am J Physiol, 1999, 277: 127-129.

14. Chen K, Gunter K, Maines MD. Neurons overexpressing HO-1 resist oxidative stress mediated cell death [ J]. J Neurochem, 2000, 75(1): 304-307.

15. SoaresMP, UshevaA, Brouard, et al. Modulation ofendothelial cell apoptosis by heme oxygenase-1 derived carbon monoxide[J].Antioxid Redox Signal, 2002, 4: 321-325

16. Choi BM, Pae HO, Jeong YR, et a.l Overexpression of heme oxygenase (HO)-1 renders JurkatT cells resistant to fas-mediated apoptosis: involvement of iron released by HO-1[J].Free Radic BiolMed, 2004, 36(7): 858-861.

17. Otterbein LE, Bach FH, Alam J, et al.ChoiAM. Carbon monoxide has antinflammatory effects involving the mito-gen-activated protein kinase pathway[J].Nat Med, 2000, 6 (4): 422-428.

18. Coito AJ, Buelow R, Shen XD, et al. Heme oxygenase-1 gene transfer inhibits inducible nitric oxide synthase expression and protects genetically fat Zucker rat livers from ischemia-reperfuion injury[ J]. Transplantation, 2002,7(4),96-101.

19. 符荣, 赵甲山, 赵洪洋, 等 一氧化碳及一氧化氮对局灶性缺血脑组织的影响[J]. 中风与神经疾病杂志, 2004, 21: 36-39.

20. Amy Bishop, Yet SF, Lee ME, et al. A key role forheme oxygenase-1 in nitric oxide resistance inmurinemotorneu-rons and glia[ J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 325(1): 3-7.

21. Inguaggiato P, GonzalezMichaca L, Croatt AJ, et al. Cel-lular overexpression of heme oxygenase-1 upregulates p21and confers resistance to apoptosis[J]. Kidney Int, 2001, 60: 2181-2189.

22. 周水秀, 吴钢. 纳洛酮对脑局灶性缺血-再灌注大鼠血红素加氧酶-1表达的影响. 中国脑血管病杂志, 2006,3(9),412-416.