Expression of GABA and its receptors in the rat spinal dorsal horn following peripheral inflammatory hyperalgesia MENG Chun*，WANG Guo-lin. Department of Anesthesiology, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052, *Tianjin Huanhu Hospital, Tianjin 300060, China
【Abstract】Objective To study the changes of the expression of GABA and its receptors in spinal dorsal horn of rats in formalin test. Methods The rats were randomly divided into two groups: six non-stimulation rats were used as control(A); six rats were subcutaneously injected 5% formalin 50μl into the right hindpaw to produce persistent nociception(B). Rats were killed after 24h respectively. Using the immunocytochemistry method, the changes of the number of GABA immunoreactive cells were observed, and the expression of the GABAAβ3 and GABAB1 receptor mRNA in the spinal dorsal horn were determinded by in situ hybridization. Results GABA immunoreactive cells and GABAB1 receptor mRNA were observed throughout the lumbar spinal dorsal horn over cell bodies with the highest density in superficial laminae Ⅰ~Ⅲ of the normal rats, and GABAAβ3 receptor mRNA was well-distributed in spinal dorsal horn compared with GABA immunoreactive cells and GABAB1 receptor mRNA. Twenty-four hours after formalin injection, a significant increase of the GABA-immunoreactive cells in ipsilaterally spinal dorsal horn was observed, the expression of GABAAβ3 and GABAB1 receptor mRNA were increased in bilateral spinal dorsal horn compared with that of A group, three parameters were positive correlation and their location of the expression in spinal dorsal horn didn’t change compared with that of A group. Conclusion GABA and its receptors may play an important role in regulating nociceptive modulation.
【Key Words】GABA; GABA receptors; The spinal dorsal horn; In situ hybridization; Immunohistochemistry
作者单位：300060 天津环湖医院麻醉科（孟春）；通讯作者：天津医科大学总医院麻醉科（王国林）
脊髓是中枢神经系统对疼痛进行调控的第一个环节，具有许多兴奋性和抑制性神经递质，对伤害性刺激起调制作用。γ-氨基丁酸（GABA）为其中的主要抑制性神经递质，它通过至少两个受体即配基-离子通道型A受体和G-蛋白偶联型B受体发挥作用，最近的研究发现作用于A受体和B受体的特异激动剂在许多动物疼痛模型中均具有镇痛效应。本研究拟观察福尔马林致痛大鼠模型脊髓腰膨大段背角GABA免疫阳性细胞，GABAAβ3和GABAB1受体mRNA表达的变化。
材 料 与 方 法
动物分组 体重在300~325g健康雄性SD大鼠（天津动物实验中心）成对饲养于笼中，安静环境12h日照/黑夜交替，全天供应水和食物。 随机分为2组：空白对照A组（n=6）；致痛B组（n=6）。
福尔马林致痛模型 大鼠右后足掌皮下用29号针头注射5%福尔马林溶液50μl。致痛成功大鼠将出现两期伤害性反应。
脊髓组织标本的制备 致痛24h后，用4%水合氯醛腹腔注射复合吸入安氟醚麻醉大鼠，仰卧位固定，开胸后经左心室插管至升主动脉，用生理盐水冲净血液，灌注含0.1%DEPC和4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）500ml。取大鼠脊髓L4~6节段，在固定液中固定24h。经梯度酒精脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，连续冠状切片，厚度为6μm。取材物品和环境用DEPC处理。
仪器与材料 石蜡切片机（Leitz1516 德国），台式恒温培养箱（THGX型 上海跃进医疗器械厂），光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。试剂：5%福尔马林溶液（37%甲醛用生理盐水稀释，使用前配制）（天津有机化学试剂厂）、多聚甲醛、DEPC、Triton X-100、牛血清白蛋白和正常羊血清（Sigma公司），1℃~4℃冰箱保存。
免疫组化方法 试剂盒为GABA（兔抗GABA）免疫组织化学染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），组织切片常规脱蜡、抗原修复后滴加稀释的一抗（1:50兔抗鼠IgG），4℃孵育过夜，DAB为显色剂，每批染色均设TBS溶液取代一抗的阴性对照。
原位杂交方法 试剂盒为大鼠GABAA Receptor β3(ionotropic)mRNA原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）、GABAB Receptor 1(metabotropic)mRNA原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），组织切片常规脱蜡、胃蛋白酶消化暴露mRNA核酸片段后，每张切片滴加20μl原位杂交液进行杂交，洗涤后滴加生物素兔抗地高辛， SABC法染色， DAB显色，每批染色均设不加地高辛抗体和探针的阴性对照。
结果观察和阳性指标计数 在高倍光学显微镜下，选取脊髓背角不重叠的4个高倍视野（400倍），计数视野范围内的阳性细胞数，计算其平均值。免疫组化阳性细胞胞浆呈棕黄色，胞核不着色（复染后呈蓝色），背景淡黄色，阴性细胞胞浆不着色。原位杂交阳性细胞胞浆呈棕黄色，胞核不着色（复染后呈蓝色），背景淡黄色，阴性细胞胞浆不着色。
统计学处理 计量资料以均数±标准差（ ）表示，以SPSS11.0进行统计分析。同鼠致痛侧与非致痛侧比较应用配对t检验，组间比较应用单因素方差分析、q检验和相关分析。以P<0.05为差异有显著性。
结 果
定位结果 实验各组脊髓腰段背角GABA免疫阳性细胞、GABAAβ3和GABAB1受体mRNA阳性细胞胞浆呈棕黄色，复染后核呈蓝色，背景淡黄色。阳性细胞分布于脊髓各层，密度存在差异：GABA免疫阳性细胞在脊髓背角第Ⅰ~Ⅱ层分布最为密集，在第Ⅳ~Ⅵ层、Ⅹ层和前角分布稀疏（图1~2）；GABAAβ3受体mRNA阳性细胞在脊髓各层分布较均匀（图3~4）；GABAB1受体mRNA阳性细胞在脊髓背角Ⅰ~Ⅲ层密度最高，第Ⅳ~Ⅷ层和第Ⅹ层内也可见其分布（图5~6）。无论是在A组还是B组，上述三个指标的形态变化不大，在脊髓层面的分布相似，但是阳性细胞数量存在差异。
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