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氯胺酮对离体白细胞炎症反应的影响
时间：2010-08-24 09:09:36 来源： 作者：
| 麻醉医生在日常工作中常面临与炎症相关的各种病理生理过程。过度的炎症反应将引起机体失代偿，造成组织器官功能损害，重者甚至死亡。如何在围手术期采取有效的措施控制患者体内过度的炎症反应是麻醉医师面临的重要课题。近年来研究发现氯胺酮具有抗炎作用，但其机制尚不清楚[1]。因此，本研究观察了氯胺酮和MK-801对趋化因子刺激下人外周血白细胞表面CD11b的表达及白细胞－内皮细胞黏附率的影响，并进一步探讨其抗炎机制。 1 材料与方法 1.1 材料 （1）实验对象：脐带由健康产妇平产无菌操作取得或剖宫产术中留取。人外周血白细胞从肘静脉抽取的健康成人肝素化静脉血5 ml（肝素40 u/ml）中分离。（2）主要试剂：Ⅰ型胶原酶为Gibco公司产品。胎牛血清为Hyclone公司产品。趋化因子（formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine, FMLP）、MK-801均为Sigma公司产品。氯胺酮为江苏恒瑞医药股份有限公司产品。淋巴细胞分离液（Ficoll-Hypaque，密度1.077±0.001 g/ml）为中国医学科学院血液学研究所产品。CD11b FITC标记单克隆抗体、IgG1同型对照抗体为Immunotech Coulter公司产品。（3）主要仪器：Olympus CK 40显微镜、EPICS-XL Bechman Coulter流式细胞仪。 1.2 方法 1.2.1 白细胞表面CD11b表达的测定 从健康成人肘静脉抽取肝素化静脉血（肝素40u/ml）随机分为等体积10组：空白组中未加入任何药物；对照组中不加入氯胺酮或MK-801，仅在30 min后加入FMLP10-6mol/L孵育20 min；氯胺酮组分为 12.5、25、100、300μmol/L 4个浓度；MK-801组分为1.25、2.5、10、30 μmol/L 4个浓度，上述8组与不同浓度的两种药物在37 ℃温箱中孵育30 min后加入FMLP10-6mol/L再孵育20 min。然后各组中加入饱和浓度的FITC标记的CD11b抗体，在4 ℃下避光30 min，用流式细胞仪进行检测。 1.2.2 人脐静脉内皮细胞的培养 采用改良的Jaffe方法[2]，新鲜的脐带冲洗干净后，用0.1%Ⅰ型胶原酶消化25~30 min。收集消化液加入20%胎牛血清，肝素90 mg/L，青霉素100 ku/L，链霉素100 mg/L置于37 ℃，5% CO2孵箱中进行培养。5~7 d待细胞长满后，进行传代，接种培养板中待实验。 1.2.3 人外周血白细胞的分离与纯化[3] 抗凝血5 ml，取样计数白细胞数后加于Ficoll-Hypaque溶液上，离心2000 rpm，20 min。吸取离心管内第4层，悬浮在0.83%Tris-NH4CL工作液中（0.1 ml压紧的红细胞加1 ml Tris-NH4CL）裂解红细胞，清洗细胞后悬浮于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，用细胞计数板计数细胞数。用0.1%吉姆萨染液鉴定细胞纯度，此法所得细胞纯度>98%。用0.2%台盼蓝染液测定细胞存活率，此法所得活细胞百分率>95%。 1.2.4 白细胞与内皮细胞黏附率的测定[4] 白细胞分为10组：空白组，将白细胞在温箱中孵育50 min后，按2.5×109/L的浓度加于培养成功的内皮细胞上。对照组，将白细胞在温箱中孵育30 min，再加入FMLP10-6mmol/L孵育20 min，按2.5×109/L的浓度加于内皮细胞上。实验组又分为氯胺酮组（12.5、25、100、300 μmol/L）和MK-801组（1.25、2.5、10、30 μmol/L），即在白细胞中加入不同浓度的两种药物在37 ℃温箱中孵育30 min，再加入FMLP10-6mol/L孵育20 min，再将白细胞按2.5×109/L的浓度加于内皮细胞上。各组均在4 ℃下黏附12 h。用0.9%甲醛固定1 h，再用0.5%龙胆紫-甲醇染液染色1 min，洗净残余的染液后在镜下进行观察。每个培养孔中随机选取10个视野，计算每个200×视野中内皮细胞数及黏附于内皮细胞上的白细胞数，从而得出白细胞-内皮细胞黏附百分率。黏附率=黏附于内皮细胞上的白细胞数/内皮细胞总数×100% 1.3 统计学分析 实验结果用 S表示，利用SPSS11.0统计软件，采用单因素方差分析，组间比较采用q检验，相关性用直线相关分析。 2 结果 2.1 白细胞表面CD11b表达的测定结果 经流式细胞仪检测发现，CD11b在静止人白细胞表面仅有少量表达，平均荧光密度（10.38±1.11）%，而在FMLP活化后其表达显著提高 (P<0.05)。12.5、25、100、300 μmol/L四个浓度的氯胺酮对FMLP活化后白细胞表面CD11b的表达具有明显的抑制作用(P<0.05)，并呈剂量依赖性关系。而MK-801无作用(P>0.05)，见表1。 7 Ichiro T, Masanori O, Kazunori K, et al. Ketamine supresses endotoxin-induced tumor necrosis factor alpha production in mice. Anesthesiology, 1994, 80: 402-407 8 Ogawa K, Tanaka S, Murray PA, et al. Inhibitory effects of etomidate and ketamine on endothelium-dependent relaxation in canine pulmonary artery. Anesthesiology, 2001, 94: 668-677 9 Weigand MA, Schmidt H,Zhao Q, et al. Ketamine modulates the stimulated adhesion molecule expression on human neutrophils in vitro. Anesth Analg, 2000, 90: 206-212 10 Szekely A, Heindl B, Zahler S, et al. S(+)-ketamine, but not R(-)-ketamine, reduces postischemic adherence of neutrophils in the coronary system of isolated guinea pig hearts. Anesth Analg, 1999, 88(5): 1017-1024 |
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