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TAT-血红素氧合酶-1融合蛋白对L-02细胞的转导效果
| 肝移植术是治疗终末期肝病的有效方法,但新肝期缺血再灌注损伤及免疫排斥反应等可导致移植肝失活。血红素氧合酶-1（HO-1）是血红素分解代谢的限速酶，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用，HO-1及其代谢产物还可抑制免疫排斥反应，并可诱导免疫耐受[1-4]。TAT是目前效果确切的蛋白转导结构域，可将与其相连的蛋白质或多肽导入细胞内发挥生物学作用[5,6]。有研究表明，TAT-HO-1融合蛋白可成功转导入胰腺β细胞[7]，而TAT- HO-1融合蛋白对肝细胞转导的效果尚有待进一步探讨。本研究通过观察TAT-HO-1融合蛋白对L-02细胞的转导能力、细胞毒性和转导后细胞内HO-1的活性，拟评价其转导效果，为临床研究提供参考。 一、材料与方法 主要试剂 人HO-1 cDNA、原核表达载体pET32a、菌株E.coli BL-21 (DE3)、E.coli DH5α、人胚肝细胞系L-02细胞（复旦大学生命科学院遗传所提供），限制性核酸内切酶、T4 DNA 连接酶（New England Biolabs公司，美国），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（上海生物工程公司），质粒小量提取试剂盒、质粒纯化试剂盒（北京赛百盛公司），Ni-NTA-agarose （Novagen公司，德国）；Amicon Ultra-15 离心超滤装置（Millipore公司，美国）， BCA蛋白定量试剂盒、EZ-Label™ FITC Protein Labeling（Pierce公司，美国），兔抗大鼠HO-1多克隆抗体（Stressgen公司，加拿大）。 TAT-HO-1-pET32a质粒的构建 参照文献[8]的方法，PCR引物由Oligo 6.0软件自行设计,北京赛百盛公司合成。HO-1 cDNA上游引物：5＇-CGGAATTCGCGGATCCATGGAGCGTCCGCAACC-3＇，下游引物：5＇-TGGAATTCGTCGACCATGGCATAAAGCCCTACAGC-3＇，扩增产物大小872bp。TAT上游引物：5＇-AGCTTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTTAAC-3＇，下游引物： 5＇-AGCATTTTTTGCAGCAGTCGCAGCAGCAATTGAGCT-3＇，扩增产物大小40bp，下划线分别为Hind Ⅲ、XhoⅠ酶切位点。TAT两端为Hind Ⅲ和XhoⅠ粘端，退火后与经Hind Ⅲ和XhoⅠ双切的pET32a线性片断连接，构建TAT-pET32a。从人cDNA库中经PCR得到人HO-1基因，5′端引入BamHⅠ酶切位点，3′端引入SalⅠ酶切位点，将其连接入TAT-pET32a的BamHⅠ和SalⅠ位点，构建TAT-HO-1-pET32a质粒。转染E.coli DH5α，碱裂解法小量抽提并纯化质粒后，经BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定。提取酶切鉴定正确的重组子质粒进行测序，测序结果与美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中标准序列比对，用质粒纯化试剂盒纯化正确的克隆。 TAT-HO-1融合蛋白的表达、纯化及定性分析 参照文献[9]的方法，抽提TAT-HO-1-pET32a质粒，转染E.coli BL-21 (DE3)，经IPTG诱导表达、Ni-NTA-agarose纯化。 SDS-PAGE电泳分析TAT-HO-1融合蛋白纯度，BCA法测定其浓度；Western blot法对TAT-HO-1融合蛋白进行定性分析，一抗为兔抗大鼠HO-1多克隆抗体，二抗为碱性磷酸酯酶标记的抗兔IgG抗体，以大鼠肝脏组织匀浆提取液作为HO-1对照，以pET-32a空载体转染的E.coli BL-21 (DE3)裂解液作为阴性对照。 TAT-HO-1融合蛋白转导能力的测定 L-02细胞置于高糖DMEM-10%胎牛血清培养基中，在37℃下含5% CO2环境中培养。将细胞接种于24孔培养板中，每孔100 μl， 5×104个/孔，随机分为3组，每组4孔。待细胞长至70%~80%融合度时, Ⅰ组加入纯FITC标签，Ⅱ组加入EZ-Label™ FITC 蛋白标记的TAT-HO-1融合蛋白100nmol/L，Ⅲ组加入标记的TAT-HO-1融合蛋白1μmol/L，孵育4 h后,用PBS冲洗3次，每次5 min，4%多聚甲醛固定细胞，DAPI细胞核染色，在倒置荧光显微镜（×400）下观察TAT-HO-1融合蛋白导入L-02细胞的情况。 TAT-HO-1融合蛋白细胞毒性的测定 用胰酶消化L-02细胞，计数细胞后稀释，接种到24孔培养板中，每孔100 μl，5×103个/孔，随机分为2组，每组4孔，在37℃下含5% CO2环境中培养24h后，组不加入任何试剂，Ⅰ组加入TAT-HO-1融合蛋白100 nmol/L，Ⅱ组加入TAT-HO-1融合蛋白1 μmol/L；4 h后加入10 μl CCK-8，孵育2 h。测定450/630nm双波长下细胞培养液的吸光度值，以不加入任何试剂时450/630nm双波长下细胞培养液的吸光度值为对照，各组吸光度值与对照值的比值反映细胞活力。 转导后L-02细胞内HO-1活性的测定 L-02细胞培养方法同上。将L-02细胞接种于24孔培养板中，5×104/孔，随机分为2组，每组4孔。待细胞长至70%~80%融合度时，Ⅰ组不加入任何试剂，Ⅱ组加入TAT-HO-1融合蛋白1μmol/L，4 h后用PBS冲洗3次，每次5 min，随后加入Tris-HCl裂解缓冲液（0.5% Triton X-100和100μg/ml PMSF）100μl ，pH 7.4，4℃下孵育30 min，收集细胞裂解液，依次加入还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH） 0.8 mmol/L、6-磷酸葡萄糖（G-6-P） 0.8 mmol /L、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）1.0 U、MgCl2 1 mmol /L和血红素 0.25 mmol/L，37℃暗室孵育15 min，冰上终止反应。4℃下2 000r/min离心5min，取上清液，测定460/530nm双波长下胆红素的吸光度值，反映HO-1活性[10]。 统计学处理 采用SPSS 11.5 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析，P < 0. 05 为差异有统计学意义。 二、结 果 TAT-HO-1-pET32a质粒测序正确。TAT-HO-1融合蛋白在E.coli BL-21(DE3)中获得高效表达，并成功纯化；纯化蛋白的Western blot鉴定结果表明,融合蛋白中含有HO-1,见图1。 Ⅰ组细胞内未见绿色荧光，Ⅱ组和Ⅲ组细胞内均匀分布绿色荧光。 Ⅱ组及Ⅲ组细胞活力分别为109%±3%和114%±10%。Ⅱ组转导后细胞内HO-1活性（1.46±0.14）明显高于Ⅰ组（0.42±0.03）（P＜0.05）。 三、讨 论 本研究采用分子克隆技术将HO-1 cDNA编码区及合成的TAT片断与原核表达载体pET32a连接，构建了TAT-HO-1-pET32a质粒，将测序结果与标准序列进行比对，证实TAT-HO-1-pET32a质粒测序正确。用测序正确的TAT-HO-1-pET32a质粒转染E.coli BL-21，经诱导表达和纯化后，经Western blot证实所得蛋白分子量（52kD）大于内源性HO-1（32 kD），提示其中含有蛋白纯化标签和TAT寡肽;TAT可将多种与其相连的蛋白质转导入多种细胞中，甚至可以穿过血脑屏障[11];本研究中L-02细胞与FITC标记的TAT-HO-1融合蛋白孵育4 h后，荧光显微镜下细胞内均匀分布绿色荧光，表明TAT-HO-1融合蛋白可以成功转导入L-02细胞，以上结果均证实本研究制备的融合蛋白中含有TAT寡肽。 TAT介导的蛋白质或多肽入胞机制包括为非受体、非转运蛋白介导和非内吞机制[12]，其入胞过程是能量依赖性的，并且需要与细胞表面的蛋白多糖发生作用[13-15]。 本研究结果表明，100nmol/L和1μmol/L TAT-HO-1融合蛋白可有效地转导入L-02细胞内，因此，在测定细胞毒性和转导后细胞内HO-1活性的实验中其浓度选择了100nmol/L或1μmol/L。 有研究表明，生物活性肽可能导致靶细胞的损伤[16]，因此本研究在细胞培养基中加入CCK-8，测定TAT-HO-1融合蛋白的细胞毒性。CCK-8中含有水溶性四唑盐，在细胞脱氢酶的作用下分解产生的可溶性黄色物质的数量与培养基中活细胞的数量成正比，通过检测其吸光度可反映细胞活力[17]。本研究结果表明,TAT-HO-1融合蛋白对L-02细胞的活力无影响，说明TAT-HO-1融合蛋白无细胞毒性。 HO-1可氧化血红素生成一氧化碳、Fe2+和胆绿素，在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、MgCl2及血红素组成的反应体系中，通过测定460/530nm双波长下胆绿素的还原产物胆红素的吸光度值，反映HO-1活性[10]。本研究结果表明，L-02细胞与TAT-HO-1融合蛋白孵育后,L-02细胞内HO-1活性明显升高，说明TAT-HO-1融合蛋白转导入L-02细胞后保留了HO-1的生物效应，这是该融合蛋白发挥其保护作用的基础。 综上所述，TAT-HO-1融合蛋白可有效地转导入L-02细胞, 使细胞内HO-1活性明显升高,且无细胞毒性，为其应用于肝移植术奠定了基础。 参 考 文 献 1 McCarter SD, Akyea TG, Lu X, et al. Endogenous heme oxygenase induction is a critical mechanism attenuating apoptosis and restoring microvascular perfusion following limb ischemia/reperfusion. Surgery, 2004, 136: 67-75. 2 Pileggi A, Molano RD, Berney T, et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes, 2001, 50: 1983-1991. 3 Sato K, Balla J, Otterbein L, et al. Carbon monoxide generated by heme oxygenase-1 suppresses the rejection of mouse-to-rat cardiac transplants. J Immunol, 2001, 166: 4185-4194. 4 Braudeau C, Bouchet D,Tesson L, et al. Induction of long-term cardiac allograft survival by heme oxygenase-1 gene transfer. Gene Ther, 2004, 11: 701-710. 5 Jarver P, Langel U. The use of cell-penetrating peptides as a tool for gene regulation. Drug Discov Today, 2004, 9: 395-402. 6 Schwarze SR, Dowdy SF. In vivo protein transduction: intracellular delivery of biologically active proteins, compounds and DNA. Trends Pharmacol Sci, 2000, 21: 45-48. |
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