引言
缺血后处理( ischemic postconditioning, IPo)可减轻心肌缺血再灌注( ischemia-reperfusion, I/R ) 损伤[ 1 - 2 ] ,还可减轻脑[ 3 ] 、肝[ 4 ]及肠的I/R损伤. 本课题的前期研究发现IPo可以抑制肾I/R损伤诱发的肾组织细胞凋亡,具有一定的肾保护作用,但是抑制凋亡的的具体机制有待探讨. 细胞凋亡是基因控制的细胞主动死亡过程,目前认为至少有两类基因与凋亡调控有关,以bcl-2为代表的抗凋亡基因和以bax为代表的促凋亡基因共同调节细胞凋亡. 本研究观察了IPo对大鼠肾I/R损伤后肾组织细胞凋亡及bcl22和bax基因表达的影响,并探讨IPo的肾保护机制.
1 材料和方法
1. 1 材料 健康雄性SD大鼠18只,体质量250～280 g,由河北省实验动物中心提供,随机分为3组:假手术组( S组) ,缺血再灌注组( I/R组) ,缺血后处理组( IPo组) ,每组6只. 术前禁食12 h,自由饮水.大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛300 mg/kg麻醉后,将大鼠仰卧位四肢固定于鼠台上,行腹正中切口,钝性分离肾包膜,显露和游离肾脏,仔细分离肾蒂,保护输尿管,用无损伤动脉夹夹闭双侧肾蒂,肾脏颜色变为暗红色即可确认肾脏血流阻断,造成双侧肾缺血45 min后,显露肾脏,松开动脉夹,肾脏由暗红色恢复鲜红色即可确认血流恢复,逐层缝合腹部正中切口.再灌注6 h即为肾缺血再灌注模型. 夹闭和放开肾蒂时腹腔内各注射林格液20 mL /kg. S组仅行开腹,游离出双侧肾脏,分离双侧肾蒂不夹闭,伤口用生理盐水纱布覆盖,暴露45 min不作肾缺血处理; IPo组夹闭双侧肾蒂45 min后,再灌注10 s,缺血10 s,反复3次,再全面恢复血液灌注6 h.
1. 2 方法
1. 2. 1 标本制备 再灌注后6 h,过量麻醉剂下经心脏抽血迅速处死动物. 将血液标本注入离心管,静置30 min, 2500 r / min 离心15 min, 提取血清标本,- 70℃冰箱保存待测. 在无菌条件下,迅速摘取左肾,分装入1. 5 mL 离心管,液氮冻存,用于进行PT-PCR. 取右肾, 40 g/L多聚甲醛固定,制备石蜡切片,4℃保存待用.
1. 2. 2 血清Cr, BUN含量的测定 应用Selectra-E全自动生化分析仪(Vital,荷兰)酶法测定血清Cr水平,苦味酸不除蛋白法测定BUN含量.
1. 2. 3 肾组织bcl-2 mRNA和bax mRNA表达的测定 取50 ～100 mg标本匀浆后, Trizol试剂提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,紫外分光光度计检测法测定RNA含量,取等量RNA逆转录合成cDNA,以β-actin为内参照,扩增bcl-2, bax 和β-actin,所有引物均由上海生物工程公司合成. 引物序列和扩增产物长度(表1). bcl-2基因扩增条件为: 94℃变性5 min,然后94℃ 45 s, 52℃ 30 s, 72℃ 45 s, 35个循环,最后72℃延伸5 min. bax基因扩增条件为:94℃变性5 min,然后94℃ 45 s, 56℃ 45 s, 72℃ 45 s,35个循环, 72℃延伸5 min. 取RT-PCR产物4μL,加上样缓冲液1μL,在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳,用凝胶图像分析系统(Gel-Pro Analyzer Version 3. 0)进行光密度测量,以目的基因与内参β-actin的比值代表该样品PCR产物的相对含量.
1. 2. 4 肾组织病理学观察和凋亡细胞的检测 HE染色,光镜下观察肾组织病理学改变. TUNEL 法测定肾组织中凋亡细胞(试剂盒购自德国Boehringer Mannhiem公司) ,细胞核呈棕黄色者为阳性细胞,随机选取5个视野,光镜下计数凋亡细胞,以肾小管上皮凋亡阳性细胞数占总肾小管细胞数的百分比作为肾小管细胞凋亡指数( apoptotic index,A I) ,A I(% ) =阳性细胞数/视野所有细胞总数×100%.统计学处理:采用SPSS 11. 5软件进行统计学分析,计量资料以 ±s表示,组间比较采用单因素方差分析, P < 0. 05为差异有统计学意义.
2 结果
2. 1 各组Cr, BUN水平的变化 再灌注6 h时,与S组相比, I/R组和IPo组Cr, BUN水平均明显升高( P < 0. 05) ,与I/R组比较,再灌注6 h时, IPo组Cr,BUN浓度降低( P < 0. 05,表2).
2. 2 bcl-2 mRNA, bax mRNA及其比值的变化 PCR所得的bcl-2, bax 和β-actin条带的大小与预期一致(扩增目的片段长度bcl-2 为702 bp, bax为407bp,β-actin为375 bp) (图1). bcl-2 mRNA电泳条带S组最明显, IPo组比较明亮, I/R组较浅. bax mRNA电泳条带S组浅暗, IPo组比较明亮, I/R组最明显. 与S组相比, I / R组和IPo组bcl -2mRNA表达量降低, bax mRNA 表达量升高, bcl-2 mRNA / bax mRNA的比值降低,差异有统计学意义( P < 0. 05) ;与I/R组比较, IPo组bcl-2 mRNA表达量升高, bax mRNA表达量降低, bcl-2 mRNA / bax mRNA的比值升高,差异有统计学意义( P < 0. 05, 表3).
2. 3 组织病理学结果 S组肾小球、肾小管未发现明显的形态学改变(图2A) ; I/R组部分肾小管上皮细胞肿胀,出现水样变性和空泡变性,肾小管扩张,内可见管型和坏死脱落细胞,少量肾小管腔内有蛋白性液体积聚,间质充血水肿,大量炎细胞浸润,管周血管明显扩张淤血(图2B) ; IPo组肾小球轻度淤血,少量肾小管上皮细胞轻度水肿、空泡变性,罕见管型,间质充血水肿,有少量炎细胞浸润管周稍有淤血(图2C).
2. 4 肾小管上皮细胞凋亡的变化 S组偶见凋亡细胞, I/R组和IPo组凋亡细胞数增加(图3). 与S组相比, 再灌注6 h时, I/R 组和IPo组A I明显增高( P < 0. 05) ; 但IPo组A I较I/R组下降( P < 0. 05, 表3).
3 讨论
本研究中I/R组Cr和BUN浓度水平明显升高,提示肾功能严重受损,肾组织形态学损伤严重,说明肾脏缺血再灌注损伤模型成功建立[ 5 ] . 本实验所采用的后处理的时间和次数是根据预实验结果和参考文献[ 6 - 7 ]确定的.
有研究表明,肾I/R损伤与肾组织细胞凋亡及其调控基因bcl-2和bax的表达密切相关[ 8 - 9 ] . bcl-2可通过抑制自由基的产生及细胞内钙超载、抑制线粒体膜的通透性、阻止细胞色素C的释放及caspase的激活等机制发挥抑制凋亡的作用. 最近有研究发现bcl-2蛋白能通过降低氧自由基活性和抑制氧自由基生成发挥抗氧化作用,还能维持线粒体的氧化功能[ 10 ] .bax是促凋亡基因,能促进细胞因子缺失而诱导细胞凋亡, bcl-2与bax可形成二聚体,两者的比例决定细
胞向存活还是凋亡方向发展. 本研究证明IPo可能通过上调肾小管上皮细胞bcl-2 和下调bax,从而使bcl-2 /bax比值升高来发挥其抗氧化、增加膜稳定性作用.
本实验所采用的缺血再灌注前、反复短暂的预再灌注、停灌注的IPo方案,在某种意义上相当于有控制的缓慢间歇性复氧,可减少突然复氧时氧自由基的爆发性产生,并刺激胞内抗氧化酶和自由基清除剂的释放而发挥保护效应. IPo发生在缺血后、再灌注前,是从建立一种更合理、更有效的再灌注角度出发, 处理和挽救已缺血肾小管上皮细胞,最大限度地减轻再灌注损伤. 而且IPo是在器官缺血后、恢复全面血流灌注前施之,方法简单、时间从容,因此可能更有直接的临床实用价值[ 11 ] .
综上所述, IPo可减轻肾脏I/R 损伤,其肾保护作用可能与其上调bcl-2 基因和下调bax 基因的表达,使bcl-2 mRNA / bax mRNA比值升高,从而抑制缺血再灌注损伤后的肾组织细胞凋亡有关.
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