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体外循环对小儿中性粒细胞凋亡及其调控蛋白的影响
Abstract: OBJECTIVE To investigate the changes in polymorphonuclear neutrophil ( PMN) apoptosis and Fas, Bcl -2 protein expression of pediatric patients undergoing open - heart surgery with ECC, and to give the experimental basis fortreating systemic inflammatory reaction syndrome ( SIRS). METHODS Thirty pediatric patients with ventricular septal defect undergoing open - heart surgery with ECC were studied. Blood samples were taken after induction of anesthesia( T0) , 30 minutes after the initiation ECC ( T1) , 30 minutes after the termination ECC (T2) and 24 hours post - operatively( T3). PMN apoptosis and the expression of PMN Fas, Bcl - 2 protein were detected by flow cytometry. RESULTS Compared with T0, the rate of PMN apoptosis reached to its lowest value at T2 ( P < 0. 05). The percentage of PMN apoptosis correlated negatively with the duration of ECC ( r = - 0. 648, P < 0. 05). Fas on PMN membrane at T2 was significantly downregulated than T0. Fas levels correlated positivelywith PMN apop tosis rate ( r = 0. 546, P < 0. 05). PMN intracellular exp ression of Bcl - 2 at T1, T2, T3 was significantly up regulated than T0 ( P < 0. 05). Bcl - 2 levels correlated negatively with PMN apop tosis rate ( r = - 0. 569, P < 0. 05). CONCLUS ION The PMN apoptosis can be delayed by ECC. The inhibition of PMN apop tosis has relation with the down regulation exp ression of Fas and the up regulation expression of Bcl - 2. 2. 1 临床资料 患儿术后无继发感染及其它疾病、无死亡,均痊愈出院。ECC持续时间(52 ±17) min,阻断升主动脉时间(28 ±11)min。 2. 2 PMN凋亡率的变化 PMN凋亡率在ECC期间明显降低,与T0比较,在T2时点达最低值( 1. 79 ±0. 57) % ,差异有统计学意义( P < 0. 05) , T3时点恢复ECC前水平( P > 0. 05) 。见表1。PMN凋亡率最低值与ECC持续时间呈负相关( r = - 0. 648, P < 0. 05) 。 2. 3 PMN膜表面Fas的表达 与T0比较, PMN膜上Fas的阳性细胞表达百分数在T2、T3时点降低,差异有统计学意义( P < 0. 05) ;与T2比较, T3时点数值开始上升,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表1。在T2时点, Fas的阳性细胞表达百分数与PMN凋亡率最低值呈正相关( r =0. 546, P <0. 05)。 2. 4 PMN胞内Bcl - 2的表达 与T0比较,在T1、T2、T3时点PMN胞内Bcl - 2的阳性细胞表达百分数升高,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表1。在T2时点,Bcl - 2的阳性细胞表达百分数与PMN凋亡率最低值呈负相关( r = - 0. 569, P < 0. 05) 。 3 讨 论 PMN的过度激活释放氧自由基、蛋白酶引起组织损伤,在ECC导致SIRS的发生、发展中起重要作用。最近研究证明, PMN凋亡是非炎性清除PMN的有效方式[ 1 ] 。进入到炎症灶的PMN只能以两个途径被清除:细胞坏死或凋亡。坏死的PMN细胞膜破裂,而凋亡的PMN在膜的完整性被破坏之前可被巨噬细胞吞噬,有效阻止了内毒性颗粒内容物的释放,并对周围组织的损伤最小。因此, PMN凋亡启动的时机和程度是决定炎性反应的程度和转归的关键因素之一。 我们的实验使用了流式细胞技术研究PMN 凋亡。研究发现, ECC开始后PMN明显受到抑制,凋亡率在ECC中和停ECC后30min均较ECC前有明显降低,并于停ECC后30min达最低,术后24h恢复ECC前水平。这与Sakai[ 2 ] 的观察结果基本一致。随着ECC的结束,炎症级联瀑布的诱发因素解除,抑制凋亡的因素也随之解除, PMN凋亡也逐渐恢复ECC前水平。而且, PMN凋亡率与ECC持续时间呈负相关,说明ECC是PMN发生凋亡延迟的因素。但是值得注意的是凋亡延迟可能不是ECC独自造成的, ChelloM[ 3 ]的研究显示非ECC下冠脉搭桥手术的患者PMN也有凋亡的延迟。因此,我们研究的小儿ECC下VSD修补术后中性粒细胞凋亡延迟可能也是ECC和手术两方面所导致的。 ECC导致的内环境的改变是一个多系统、多环节、多通路调节的复杂过程, ECC延迟PMN凋亡的具体机制目前尚不完全清楚。PMN可在多种外界因素的作用下发生凋亡的延迟或加速,此过程是一个受自身多基因调控、众多细胞因子参与、多条信号转导途径独立或交联形成的复杂调控网络。因此,炎症时PMN凋亡信号转导通路和相关基因的变化是揭示PMN凋亡延迟机制的关键所在。 细胞凋亡主要信号转导通路包括:线粒体途径、死亡受体途径及caspase - 12 内质网激活途径,在PMN中死亡受体通路( Fas/FasL)是促进凋亡的基本通路。因此,为了研究ECC下心脏手术中的凋亡延迟机制,我们对PMN细胞膜上Fas的表达的变化进行观察。研究结果显示PMN膜上Fas的阳性表达细胞数在停ECC后30 min降低,术后24 h有所升高,说明已经开始恢复。Fas表达的下调,提示PMN的凋亡延迟可能与Fas/FasL 介导的信号转导通路有关。Fas的作用在机体清除受病原体感染而活化的免疫细胞过程中是必需的,因此Fas表达障碍,将不能有效清除活化的炎性细胞,导致过度炎性反应和自身免疫紊乱;而Fas基因的超量表达,也将引起多种炎性细胞和实质细胞的过度凋亡。另有研究表明, Fas和FasL基因的调节紊乱所引起的免疫和炎性细胞凋亡信号改变可能是SIRS和多脏器功能不全综合征(MODS)发生的一个重要机制, Fas介导的免疫或实质细胞的程序化死亡与MODS和脓毒症发生及预后有关[ 4 ] 。此外, ECC过程中过量释放的炎性因子如TNF -α、IFN - γ、IL - 8、LPS等,可通过调控Fas等凋亡基因的表达从而抑制PMN的凋亡[ 5 ] 。因此,可以通过调节PMN Fas的表达来对抗停ECC后凋亡延迟,减轻由于PMN的过度活化而导致的过度炎性反应。目前就有一种白细胞抑制装置( leukocyte inhibition module,L IM) ,通过血液和免疫调节生物膜的短暂接触,激活Fas,使PMN 在短时间内失活。一项猪的载体动物实验中将其连接于管路动脉端,就没有观察到PMN的凋亡延迟,认为L IM能够显著抑制PMN的激活[ 6 ] 。 成熟的PMN表达的Bcl - 2家族有抗凋亡和促凋亡两类蛋白,它们是与线粒体途径相关的主要调节因素。在炎性条件下,由于NF - κB 的激活诱导抗凋亡蛋白的合成增加,在与促凋亡蛋白的较量中占上风[ 7 ] 。因此,我们选择Bcl - 2家族中的抗凋亡蛋白Bcl - 2作为研究对象。研究结果显示PMN胞内Bcl - 2的阳性表达细胞百分数, 与ECC 前比较ECC 开始后30 min、停ECC后30 min、术后24 h依次升高,表明PMN胞内Bcl - 2表达上调。Bcl - 2作为一种凋亡抑制蛋白,被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一。由此可见, PMN胞内Bcl - 2表达的上调,可能是PMN凋亡受到抑制的机制之一。 综上所述,小儿ECC多种非生理性因素使PMN凋亡受到抑制,其机制与PMN 的Fas表达下调和Bcl - 2表达上调有关,为今后从PMN凋亡调控入手防治ECC引发SIRS提供了新思路。 参考文献: [ 1 ] Haslett C. Granulocyte apop tosis and its role in the resolution and control of lung inflammation [ J ]. Am J Resp ir Crit Care Med, 1999, 160 (5 Pt 2) : S5 - 11. [ 2 ] Sakai Y, Watanabe T. Inflammatory response during cardiopulmonary bypass: neutrophil apop tosis [ J ]. Kyobu Geka, 1998, 51 (12) : 1024 - 1026. [ 3 ] ChelloM,Mastroroberto P, Quirino A, et al. Inhibition of neutrophil apoptosis after coronary bypass operation with cardiopulmonary bypass[ J ]. Ann Thorac Surg, 2002, 73 (1) : 123 - 130. [ 4 ] Papathanassoglou ED, Moynihan JA, McDermott MP, et a l. Expression of Fas (CD95) and Fas ligand on peripheral blood mononuclear cells in critical illness and association with multiorgan dysfunction severity and survival [ J ]. Crit Care Med, 2001, 29 (4) : 709 - 718. [ 5 ] ScholzM, Simon A, BergM, et al. In vivo inhibition of neutrophil activity by a FAS(CD95) stimulatingmodule: arterial inline application in a porcine cardiac surgerymodel[ J ]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2004, 127 (6) : 1735 - 1742. [ 6 ] Dunican AL, Leuenroth SJ, Grutkoski P, et al. TNF alpha -induced suppression of PMN apoptosis ismeliated through interleukin - 8 production[ J ]. Shock, 2000, 14 (3) : 284 - 288. [ 7 ] Akgul C, MouldingDA, Edwards SW. Molecular control of neutrophil apoptosis[ J ]. FEBS Lett, 2001, 487 (3) : 318 – 322. |
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