目前发现的5种内源性阿片肽，包括β-内啡肽、脑啡肽、强啡肽、孤啡肽和内吗啡肽中，以内吗啡肽镇痛作用最强^[1]。Zadina等^[2]1997年从牛前脑皮层中分离纯化出一种四肽，是μ阿片受体高亲和力和高选择性的内源性配体，命名为“内吗啡肽”，其镇痛效能与吗啡相近，且对于吗啡无效的神经源性疼痛仍有镇痛作用。但外源性内吗啡肽也存在心血管等副作用，同样具有耐受性和成瘾性，而且在体内的降解速度较快^[3]。这些缺点限制了外源性内吗啡肽的直接应用，但作为体内的内源性物质，内吗啡肽的发现仍为临床医师提供了一种新的镇痛治疗思路，即基因治疗方案。转基因表达的内吗啡肽可由靶控的器官或相邻组织定向、持续地以可诱导的方式合成和分泌，直接作用于细胞本身或邻近细胞，解决了临床上常规药物半衰期短的问题；而且这种持续分泌的方式可以避免临床上因高剂量药物带来的不良反应，有效地避免或减少了耐受现象的发生。

前期研究^[4-5]发现以小鼠神经生长因子前导肽（PN）为外分泌肽，以β-内啡肽为目的基因，分泌产物能够缓解大鼠神经病理性疼痛。为了取得更好的镇痛效果，本研究拟构建携带小鼠神经生长因子前导肽（PN）和人内吗啡肽-2（EM-2）融合基因的重组非增殖型腺病毒，体外转染细胞，观察EM-2的表达情况，为进一步将其应用于慢性疼痛动物模型奠定基础。

1　材料和方法

1.1仪器和试剂  质粒和细胞株：pUC19质粒、大肠杆菌TG1菌株由复旦大学遗传学研究所提供；质粒pTCNE（含PN、EM-2序列）为本实验室前期构建^[7]；黏粒载体pAxCAwt及菌株LE392为日本TaKaRa公司腺病毒表达载体试剂盒所带。人胚肾细胞株293(ATCC CRL-l573), NIH3T3细胞为中国科学院上海细胞生物学研究所提供。PCR试剂盒、限制性内切酶、T4-DNA连接酶等为美国BioLabs公司产品；DNA分子量标准品为上海皓嘉科技发展有限公司产品；腺病毒表达载体试剂盒为日本TaKaRa公司产品；质粒纯化试剂盒为德国Qiagen公司产品；DNA包装蛋白为美国Novagen公司产品。EM-2酶联免疫反应（enzyme immunoassay, EIA）试剂盒购自北京康肽生物科技有限公司。

HH-W21-600型电热恒温水浴箱购自上海医用恒温设备厂；5804/5804R型台式高速离心机购自德国Eppendorf公司；PC707-02型PCR仪购自日本STEL公司；CK-40-F200型倒置显微镜购自日本Olympus公司；HWO301-VBA型CO₂培养箱购自美国Harris公司。DMEM、胎牛血清为Gibco公司产品；胰蛋白胨、酵母提取物购自美国Oxoid公司；琼脂糖、琼脂粉购自美国Difco公司。

1.2 目的基因的获取与鉴定　PCR方法从质粒pTCNE中扩增出401 bp的融合基因PN-EM-2。将PN-EM-2及pUC19质粒分别由EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后，胶回收，纯化后用T4-DNA连接酶16℃连接过夜，命名为pUC19-PN-EM-2，转化E．coli DH5α感受态细胞，表达产物进行测序鉴定。

1.3 重组腺病毒黏粒的构建及鉴定　pAxCAwt黏粒用SwaⅠ酶切，pUC19-PN-EM-2质粒用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后用Klenow两端补平，再用T4-DNA连接酶16℃过夜将两者连接。酚氯仿抽提、纯化后用DNA包装蛋白包装，转染LE392细菌，挑取菌落培养抽提黏粒。PCR扩增出阳性且SwaⅠ酶切未被切断的黏粒判断为重组阳性克隆。用PCR方法进行正、反向鉴定，后进一步用SalⅠ酶切，自连后转染TG感受态菌，抽提质粒后用BamHⅠ酶切电泳再次证实。

1.4 重组腺病毒的制备、鉴定及滴度测定　用脂质体转染法将8 μg黏粒DNA与5 μl DNA-TPC转染293细胞。观察细胞死亡和病毒扩增情况，收集细胞发生死亡的样孔中培养液，反复冻融数次，上清保存于－80℃。重组腺病毒的鉴定用上述上清液感染293细胞及HeLa细胞，293细胞受病毒感染而HeLa细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判断为重组腺病毒株，丢弃HeLa细胞出现病态反应的克隆，选取上述复制缺陷型腺病毒再用PCR鉴定。用50％组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度，重复3次，取平均值。

1.5 重组腺病毒的体外转染及EM-2蛋白的表达　用六孔板常规培养NIH3T3细胞，2×10⁵细胞/孔。按MOI＝10进行病毒感染试验，对照组分别为带绿色荧光增强蛋白Ad-EGFP组和无病毒感染组。感染后第1、3、7天吸取细胞培养液，EIA（enzyme immunoassay）方法测定其内EM-2蛋白的浓度。

1.6 统计学处理　计量资料以x±s表示，用SAS 8.2统计软件进行分析，组间和组内比较均采用近似F检验（SNK-q），P<0.05具有显著差异。

2　结果

2.1　融合基因的鉴定　酶切鉴定结果显示，小鼠PN和人EM-2融合基因片段为401 bp（图1），与预期结果一致。测序结果亦与预期一致（图未列出）。

2.2　PN-EM-2-pAxCAwt重组黏粒的鉴定　PCR扩增出阳性且SwaⅠ酶切未被切断的黏粒判断为重组阳性克隆。在阳性克隆中进一步行PCR(上游引物)，扩增出508 bp条带的为正向插入序列，未扩增出条带的为反向插入序列（图2）。取扩增出条带的克隆进一步用SalⅠ酶切，得到5 775 bp大小的片断，自连后转染TG感受态菌，LB培养挑取阳性克隆，抽提质粒后用BamHⅠ酶切电泳，2 592 bp和3 183 bp的片断被进一步证实为正向插入序列。

2.3　腺病毒阳性克隆及重组腺病毒株的筛选　阳性克隆可以扩增出401 bp大小的融合基因条带（图3）。野生型病毒的鉴定时，293细胞受病毒感染而HeLa细胞无明显病毒感染现象的克隆初步判断为重组腺病毒株，而后进一步用PCR法鉴定野生病毒，野生病毒可扩增出大小为880 bp的目的片段，而重组病毒为复制缺陷型，不能扩增出目的片段，故扩增出目的片段的加以去除（图4）。

2.4 病毒滴度的测定结果  经扩增及纯化，TCID50方法测定病毒滴度为2.03×10¹⁰ pfu／ml。

2.5 转基因的体外表达  EIA方法测定转染后上清内啡肽-2蛋白浓度，结果说明:插入到病毒基因组内表达EM-2<span style="LINE-HEIGHT: 150%; FONT

3　讨论

慢性疼痛是目前最常见也最缺乏有效治疗手段的疾病，是一个世界性难题。静脉或口服阿片类药物是目前缓解疼痛的最佳方法，但会带来很多不良反应，“内源性吗啡”－－内吗啡肽的发现为疼痛的治疗开辟了一条新的途径。 但是如果将腺病毒直接转染这些神经元进行基因治疗，并不能分泌成熟的内吗啡肽。因此，在应用EM-2作为目的基因进行转染表达时需要考虑未成熟肽的水解和成熟肽的分泌机制。

Beutler等^[6]将小鼠神经生长因子前导肽与人β-内啡肽编码基因融合，用这种融合基因重组的逆转录病毒转染NIH3T3细胞，培养基中可检测到高浓度的β-内啡肽，而对照组并未检测到表达。这就提示可以利用旁分泌的机制在细胞内转染目的基因载体，利用信号肽酶或相应的蛋白水解酶的水解，使目的基因与信号肽或前导肽分离，并分泌至细胞外^[7-8]。国内尤圣武^[4]、徐学武^[5]等分别成功构建了携带神经生长因子前导肽-β-内啡肽融合基因的重组腺病毒，以及携带神经生长因子前导肽-β-内啡肽融合基因的腺病毒-腺相关病毒杂合病毒，这两套系统在体外转染A431细胞后可检测到β-内啡肽的大量表达。大部分分泌性蛋白从翻译到转运进入核糖体都需要60～80个氨基酸长度，小于这个长度可能很快降解而不能产生足量的分泌蛋白^[4]。而神经生长因子的第二前导肽有121个氨基酸，与内吗啡肽-2基因构成的目的基因，能够满足分泌条件。研究^[9-10]表明，只要PN中的两个主要信息编码盒存在，就能产生和分泌稳定的成熟蛋白，而采用信号肽分析软件分析它的断裂部位与实际断裂部位并不相同，但是如果在前导肽尾部连接一个furins酶的酶切位点，就可以产生成熟的内吗啡肽-2。

本研究中采用的目的基因序列是根据GenBank登录的小鼠PN和人内吗啡肽-2序列拼接而成的，并且对PN末端的一个碱基行点突变，使其能够识别内吗啡肽-2的第1个氨基酸Tyr，从而由furins酶将其剪切并分泌至细胞外。本实验在体外转染NIH3T3细胞后，检测到较高浓度的EM-2的表达（P<0.05），但是EM-2作为四肽的短肽，其多克隆抗体的抗原性不够强，而且容易受到其他小片断肽或氨基酸的影响，导致背景表达量较高。在转染细胞后的第1、3、7天内随着时间的延长EM-2表达水平呈现明显的上升趋势，但是由于体外细胞培养时细胞生长、培养液等的局限，使蛋白表达的长期观察受限，因此还需要动物实验的进一步验证。

腺病毒载体和其他基因载体系统相比，具有宿主范围广、感染率高；靶细胞内多拷贝高效表达；理化性质稳定；遗传毒性较低等优点，是目前研究最多的载体^[11]。以往的重组腺病毒产生步骤为首先将所获目的基因插入穿梭质粒，构建成转移质粒，然后将转移质粒与腺病毒空病毒DNA共转染293细胞，筛选得到重组腺病毒。该方法虽然具有穿梭质粒较小，目的基因易于插入的优点，但所产生的腺病毒中野生型腺病毒占了相当大的比例，故重组腺病毒产生效率不高且筛选困难^[11]。而用基因组DNA末端蛋白复合物和重组黏粒共同转染293细胞的方法使重组腺病毒阳性提高了几十倍到几百倍^[12]，该系统较其他腺病毒系统在重组腺病毒的产生方面更为稳定可靠。但由于所用的黏粒较大，所以使用DNA包装蛋白对提高转染率起到了至关重要的作用。同样，在鉴定黏粒载体中是否有目的基因插入及插入方向时，直接用酶切鉴定几乎是不可能的。因此，本研究在用PCR粗筛后，用SalⅠ酶切并自连成为带有目的基因的亚克隆重组质粒，进一步酶切鉴定是否有插入及插入方向，较好的解决了片断大的问题。

总之，本研究成功构建能够在非神经内分泌细胞内转基因表达成熟人EM-2的非增殖型腺病毒，为进一步将其应用于慢性疼痛的基因治疗奠定了基础。

[参考文献]
[1] Yu Y, Cui Y, Wang X, et al. In vitro characterization of the effects of endomorphin 1 and 2, endogenous ligands for mu-opioid receptors, on mouse colonic motility[J].Biochem Pharmacol,2007,73: 1384-1393.
[2] Zadina J E, Hackler L, Ge L J, et al. A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor[J].Nature,1997,386: 499-502.
[3] Janecka A, Kruszynski R, Fichna J, et al. Enzymatic degradation studies of endomorphin-2 and its analogs containing N-methylated amino acids[J]. Peptides,2006, 27:131-135.
[4] 尤圣武，俞卫锋，于布为，等.重组小鼠神经生长因子前导肽和人β-内啡肽融合基因非增殖型腺病毒的构建和鉴定[J]. 中华麻醉学杂志,2004，24: 896-900.
[5] 徐学武，俞卫锋，王星华，等.含人β-内啡呔融合基因的腺病毒/腺相关杂合病毒载体的构建与鉴定[J].生物技术，2005，15:6-8.
[6] Beutler A S, Banck M S, Bach F W, et al. Retrovirus-mediated expression of an artificial beta-endorphin precursor in primary fibroblasts[J].J Neurochem,1995,64: 475-481.
[7] Hosaka M, Nagahama M, Kim W S,et al. Arg-X-Lys/Arg-Arg motif as a signal for precursor cleavage catalyzed by furin within the constitutive secretory pathway[J].J Biol Chem,1991,266: 12127-12130.
[8] Koo B H, Longpre J M, Somerville R P, et al. Cell-surface processing of pro-ADAMTS9 by furin[J].J Biol Chem,2006,281: 12485-12494.
[9] Okun M M, Eskridge E M, Shields D. Truncations of a secretory protein define minimum lengths required for binding to signal recognition particle and translocation across the endoplasmic reticulum membrane[J].J Biol Chem,1990,265: 7478-7484.
[10] Ren B, Shen Y, Shao H, et al. Brain natriuretic peptide limits myocardial infarct size dependent of nitric oxide synthase in rats[J].Clin Chim Acta,2007,377(1-2): 83-87.
[11] Schalk J A, de Vries C G, Orzechowski T J, et al. A rapid and sensitive assay for detection of replication-competent adenoviruses by a combination of microcarrier cell culture and quantitative PCR[J].J Virol Methods,2007,doi:10.1016/j.jviromet.2007.05.010[Epub ahead of print]
[12] Miyake S, Makimura M, Kanegae Y, et al. Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93: 1320-1324.