急性肺损伤(ALI)是现代危重病医学的一大难题，若不能得到及时有效的治疗，往往会发展成急性呼吸窘迫综合症(ARDS)，严重危及患者生命，并耗费大量的医疗资源。目前认为NF-κB和中性粒细胞(PMN)活化在ALI的发病中起了至为关键的作用，理想的治疗似乎应围绕抑制NF-κB活化和抑制PMN积聚、浸润和损伤肺血管内皮细胞这两个关键点展开。乌司他丁(UTI)是一种广谱蛋白酶抑制剂，临床上广泛用于脏器保护。UTI是否通过抑制NF-κB活化，从而抑制炎症介质过度释放和减轻PMN浸润，发挥肺保护作用，目前尚不清楚。本研究旨在探讨UTI治疗ALI的分子生物学机制，为临床治疗性应用提供理论依据。

1         材料与方法

1. 1  实验材料：健康雄性SD大鼠36只，体重180~200g，由第二军医大学实验动物中心提供。脂多糖（LPS 055：B5，Sigma公司，美国），乌司他丁（UTI，广东天普生化医药公司）。髓过氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)测试盒均购自南京建成生物工程研究所，羊抗鼠NF-κB抗体（Neomarker公司，美国），EnVisionTM免疫组化试剂盒（Dako公司，丹麦），TNF-α ELISA试剂盒（深圳晶美生物技术公司）。美国i-STAT多功能血气分析仪，紫外分光光度计（Pharmacia Biotech公司，德国），Hettich Universal 16R冷冻离心机（Hettich，德国），RM2145切片机（Leica公司，德国）。

1. 2  动物分组及模型制备：3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，将大鼠固定于实验手术台上，碘尔康消毒，行右侧颈动脉和股静脉游离术。用24号套管针分别进行动、静脉置管，丝线固定导管。动物随机分为3组：健康对照组(NC组)，肺损伤组(LPS组)，乌司他丁治疗组(UTI组)，每组12只。按文献方法复制大鼠ALI模型^[1,2]，LPS组和UTI组按5mg/kg体重计算出LPS用量，稀释至2ml，经股静脉缓慢注入，对照组注入2ml生理盐水。UTI组在注射完LPS后，继续经股静脉注入乌司他丁50,000u/kg，配制成1ml溶液，其余两组注入等量生理盐水。

1. 3  检测指标与方法

   1. 3. 1  动脉血气分析：分别于颈动脉置管完成即刻（T0）、2h（T1）、4h（T2）采血测定PaO₂。

   1. 3. 2  肺组织标本收集：每组分别于LPS注射后2h和4h经颈动脉放血处死6只动物，碘尔康消毒后，行开胸取肺术。取左下叶于15%福尔马林中固定，用于病理切片观察，左上叶用于测定肺湿/干质量比，右肺于-70℃冰箱内冻存，用于其它指标检测。

   1. 3. 3  肺组织病理学观察：15%福尔马林浸泡固定24h后，石蜡包埋、切片，常规苏木精-伊红(HE)染色，于100倍光镜下观察肺组织的病理学改变。

   1. 3. 4  肺湿/干质量比值：左上叶称取湿重后放入60℃恒温干燥箱内，一周后称取其干质量，计算W/D比值。

   1. 3. 5  NF-κB的免疫组化检测：采用EnVisionTM免疫组化法，40倍物镜下检测不同组组织切片中NF-κB表达阳性的细胞数(棕褐色细胞)，每例随机测绘10个视野，每组测绘60个视野，求其平均数。

   1. 3. 6  TNF-α蛋白含量测定：采用ELISA法，取肺组织约500 mg，用0.01 mmol/L PBS（pH 7.4）0.5 ml匀浆后，4℃、12 000 r/min离心20min，收集上清，采用双抗体夹心ELISA法，按试剂盒说明书要求操作。

1. 4  统计学分析：计量资料以均数±标准差(   ±s)表示，组间比较采用SPSS11.0统计软件作配对t 检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

  2. 1  动脉血气分析：LPS组大鼠PaO₂出现渐进下降，4h时下降至91.35±4.70mmHg (1mmHg=0.133kPa)。UTI组2h和4h的PaO₂均优于LPS组(114.50±5.49 vs 97.46±6.16, 103.28±3.90 vs 91.35±4.70; P<0.05, respectively)，两组间PaCO₂未见显著差异。UTI组的PaO₂仍明显低于NC组(P<0.05)。见表1。

  2. 2  肺组织湿/干质量比值：LPS组的W/D比值明显高于NC组，LPS组在4h有最大的W/D比值，达到5.46±0.37(P<0.01)。UTI组的W/D比值较LPS组低，但较NC组有明显增高(P<0.05)。见表2。

  2. 3  肺组织MPO和MDA含量：LPS组的MPO活性最高，其次为UTI组，均明显高于NC组(P<0.01) 。LPS组和UTI组的MPO呈逐步升高趋势。类似改变也见于MDA含量的变化。见表3。

  2. 4  肺组织病理学观察：光镜下可见NC组大鼠肺泡结构正常(图1)，LPS组发生了明显的病理形态改变：小叶结构紊乱，肺毛细血管明显扩张、充血，白细胞附壁，肺泡间隔增厚，有大量白细胞渗出、聚集，大量肺泡腔内可见渗出、出血，肺泡塌陷、不张，以LPS4h组的改变最为明显(图2、图3)。UTI组的肺结构也出现了病理形态改变，肺毛细血管扩张、充血，白细胞附壁，肺泡间隔增厚，白细胞积聚，但在程度上较LPS组轻，部分肺泡腔内可见少量渗出、出血(图4、图5)。

  2. 5  NF-κB免疫组化染色结果：NC组的支气管壁及肺组织仅见少量散在的NF-κB阳性细胞，主要位于气道黏膜上皮细胞及血管内皮细胞，肺间质中几无NF-κB阳性细胞表达(图6)。LPS组的气道黏膜及肺组织中，可见大量NF-κB阳性细胞，主要见于气道黏膜上皮细胞、浸润的炎性细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞(图7、8)。UTI组的NF-κB阳性细胞在数目上少于LPS组 (图9、10，表4)。

  2. 6  TNF-α蛋白含量：LPS致伤后2h和4h，肺组织匀浆中的TNF-α浓度较NC组显著升高(P<0.01)，且2h组的TNF-α浓度高于4h组。与NC组比较，UTI组的TNF-α也出现了显著升高(P<0.01)，但较LPS组要低。见表5。

3  讨论

目前认为ALI绝大部分表现为PMN依赖性，在致病因素作用下，PMN在肺部大量积聚，释放多种炎症介质，造成肺毛细血管内皮细胞损伤，使肺泡膜通透性增加，是ALI的本质所在^[3~5]。PMN中含有髓过氧化物酶(MPO)，且每个细胞中所含的酶的量是一定的，约占细胞干重的5%，通过测定MPO可定量计算出中性粒细胞的数目。丙二醛(MDA)的含量常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度^[6]。本实验结果显示，与对照组相比，在LPS注射后2h、4h时，LPS致伤组大鼠肺组织匀浆中的MPO和MDA含量均出现了显著升高(P<0.01)，PaO₂出现了明显下降，HE染色下可见肺组织结构发生了明显损伤，肺W/D比值明显升高，提示确实发生了急性肺损伤并伴有大量PMN在肺部聚集。

乌司他丁(UTI)是一种典型的Kuniz型蛋白酶抑制剂，能抑制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G等多种水解酶的活性。UTI对单核／巨噬细胞、中性粒细胞过度释放的炎性介质有抑制作用^[10,11]。在大鼠肺I／R实验中证实，UTI可有效抑制TNF-α的释放、氧自由基生成和膜脂质过氧化，肺组织病理切片可看到肺充血、出血、渗出和炎症细胞浸润等I／R损伤明显减轻^[12]。大量临床研究证实，UTI有较好的脏器保护作用，可明显改善ALI/ARDS患者的预后^[13,14]。本实验中UTI治疗组的PaO₂明显高于LPS组(P<0.05)；肺组织病理切片结果也显示UTI组在肺泡间隔厚度、间质水肿、炎性细胞浸润方面均比LPS组有明显减轻，肺泡腔渗出、出血少见。肺W/D比值、MPO和MDA含量较LPS组有明显下降。可见UTI能减轻LPS诱导的肺损伤，改善动脉血氧分压，对中性粒细胞的积聚、浸润、渗出有抑制作用，并减少了脂质过氧化物的生成，起到了较好的肺保护作用。

核因子-κB (NF-κB)是一类能与多种基因启动子部位的κB序列发生特异性结合并促进转录的蛋白质的总称。NF-κB被激活后，进入细胞核内，启动和调控多种与炎症反应有关的细胞因子(IL-1β、TNF-α等)、黏附分子和趋化因子的基因表达。Blackwell 等^[7]发现，基础状态下核蛋白中仅有少量的NF-κB表达，注射内毒素后约1h，NF-κB表达明显增强，其高峰出现在给药后2.5h，7h后NF-κB又回到基础水平。同时，相应时间点大鼠中性粒细胞趋化因子(CINC) 的mRNA 含量也明显高于对照组。通过抑制NF-κB的活化，CINC mRNA 表达量显著降低，伴有肺部炎症减轻，表明阻断NF-κB 的激活可明显改善肺部炎症的程度。在休克诱导的急性肺损伤模型中，肺组织中NF-κB被激活的同时，伴有IL-1β、TNF-α及TGF-β₁等细胞因子mRNA 表达增高，而这些mRNA 表达都是受NF-κB调控的，通过阻断NF-κB活化可减轻内毒素血症时肺组织水肿、PMN积聚和炎性细胞因子的表达^[8]。本实验免疫组化结果显示，对照组NF-κB阳性细胞表达很少，LPS组出现大量的NF-κB阳性细胞，UTI组的NF-κB阳性细胞在数目上较LPS组有明显减少；与LPS组比较，UTI组的TNF-α蛋白含量也明显降低。表明UTI可通过抑制NF-κB活化减少TNF-α的合成，从而减轻肺部的炎症反应。

NF-κB被激活后导致大量炎性细胞因子过度表达和中性粒细胞活化致伤是引起ALI发生发展的共同轴心环节^[9]。在发生ALI后，早期通过各种方法抑制NF-κB活化可减轻肺损伤^[8,15]。本实验结果亦表明，在ALI发病初期及时应用UTI，可通过抑制NF-κB活化，减少TNF-α的合成和PMN的积聚、浸润，减轻肺部的炎症反应，发挥肺保护作用，具有很好的临床应用价值。

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