The Analgesic Progress in Transplanted Stem Cell-derived Neural Cell<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

项红兵^＊　招伟贤^＊　孙旭芳^＃

^＊广东省中医院麻醉科，广州 510120

^＃华中科技大学同济医学院附属同济医院，武汉 430030

Hong-bing Xiang， Wei-xian Zhao， Xu-fang Sun

Department of Anesthesiology，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510120

ABSTRACT

The advances in the differentiation of stem cell into neural cell, the differentiation control of stem cell, the restriction of transplanted neural cell lineages, and analgesic gene expression of transplanted neural cell lineages were reviewed.

Key words: Stem cell; Gene treatment; Analgesia

Corresponding author: Hong-bing Xiang, MD; E-mail: xhbtj2004@163.com

目前，细胞镇痛在动物实验研究方面取得了大量的资料和经验，但因难以培养高纯度和难以获得较多性状一致的可移植细胞株，从而限制了其临床上的应用。近年来，随着对干细胞可控性分化研究的不断深入，有望在细胞镇痛领域获得突破。

一、干细胞分化为神经细胞研究概述<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

有关可移植的神经细胞株研究，得益于近年来对干细胞定向分化认识的不断深入。近年来，国内外学者对干细胞分化进行了积极的探索，业已见报道的集中于以下几类干细胞:

1. 胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES)，由于其具有不衰老的无限增殖能力及向多胚层分化潜能而给疾病的治疗带来了希望，然而由于其来源于早期胚胎，ES细胞的应用面临伦理学方面的巨大压力^[1]。另外，已有的ES细胞系不可能对所有需要移植的患者都具有免疫相容性^[2]。

2. 神经干细胞(Neural stem cell, NSC)则存在分化方向有限^[3，4]，同时其移植后存在增殖和迁移能力差^[5，6]等缺点。

3. 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)来源于骨髓，取材方便，似乎是合适之选，但其增殖能力相对较差，由于来源于中胚层，要分化为来源于外胚层的神经细胞在生物发育学缺乏依据，而对于有人提出的成人组织干细胞横向分化的问题，目前科学界争议很大，理论上尚难成立^[7]。

2001年Reyes等^[8]在培养骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)时发现了一小群可能较MSCs更原始的细胞，似乎兼具了ES细胞及成人组织干细胞的优点而又弥补了它们的缺点，他们将其命名为成体多潜能先祖细胞(Multipotent adult progenitor cells, MAPCs)，并先后在小鼠、大鼠及人类骨髓中获得了这种细胞。研究表明MAPCs需要的培养环境与ES细胞相似，并表达ES细胞的遗传学标记物，如Oct-4及Rex-1等^[9]，它们都是维持ES细胞未分化状态的重要转录因子。MAPCs可以在体外不衰老地无限制地增殖，可以传代超过120代而保持细胞形态及表形不变。其染色体端粒的长度在传代过程中保持不变。更重要的是MAPCs还具有向各个胚层的多种细胞分化的潜能，在单细胞水平可以分化成三个胚层来源的细胞^[9]。

二、调控干细胞分化为神经细胞方法

有效调控神经细胞的分化，通常有两种方法^[10] : 其一是细胞系筛选，这需要相对特异的细胞系标志，如Marius等^[10]利用Tau基因中插入的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）来筛选胚胎干细胞分化来的神经元；Chrlslian等^[11]利用Nestin在神经前体细胞内表达的特性，采用Nestin特异性启动子控制的EGFP表达来筛选胚胎干细胞来源的神经前体细胞。其二是定向诱导，这需要探索严格的分化外环境和特定的细胞因子作用，但也面临分化的细胞多样性的问题。Jiang等^[9]诱导MAPCs分化成神经细胞，包括神经元，星形胶质细胞及少突胶质细胞，其中约70％为神经元，并发现神经元中含有多巴胺、五羟色胺、γ-氨基丁酸等神经递质。这说明，成体多潜能先祖细胞（MAPCs）所分化的多种细胞在体内及体外都具有正常的功能。在将单个的MAPCs细胞注射入囊胚期的胚胎中，发现其可植入到各种组织中，形成较平衡的嵌合体，提示MAPCs是一种较为原始的干细胞。将这种未分化的MAPCs细胞通过尾静脉注射入成年鼠体内，发现其可参与形成多种组织细胞，并具有正常的功能，但没有发现其致瘤性^[9]。MAPCs可在骨髓以外的组织中被分离和培养，Jiang等^[12]在骨髓、肌肉及脑中均分离并培养出了MAPCs，均能传代大于70代，并且都能分化成三个胚层的(内皮细胞、神经元、胶质细胞及肝细胞等)细胞，且在这三种组织中获得的MAPCs的形态及表型特征是一致的。诱导MAPCs分化成神经细胞的技术正在进行之中。

国内已有学者将上述两种方法结合在一起使骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为神经胶质细胞^[13]，其方法是在体外进行相对定向诱导使MSCs表达胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），经重构的质粒载体转染后，特异性GFAP启动子就能开启下游的绿色荧光蛋白，由于绿色荧光蛋白的表达、GFAP的表达与处于分化状态中神经胶质细胞形态的变化密切相关，且表达绿色荧光蛋白的神经胶质细胞可以通过荧光显微镜观察，通过流式细胞仪得到分离纯化，因此该方法可以用来标记MSCs来源的神经胶质细胞并监测其分化过程和去向，甚至从MSC分化来的多种细胞中分离出用于体内移植神经胶质细胞。

三、可移植神经细胞株的筛选

神经细胞植入后与受体中枢神经系统具有较好的组织相容性，免疫排斥反应较弱，是中枢性细胞移植镇痛较好的细胞载体选择，但天然神经细胞不具备传代扩增的能力，因此筛选并建立能够传代扩增的神经细胞是细胞镇痛领域中研究的热点。神经细胞分为神经元和神经胶质细胞，后者包括有Schwann细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等。鉴于星形胶质细胞是主要的神经胶质细胞，它对神经元具有绝缘、营养、保护和支持的作用，能维持中枢神经系统内的稳态，调节神经递质和突触信息的传导，因此目前星形胶质细胞株被公认是转基因神经细胞移植镇痛较好的细胞来源。

筛选到的星形胶质细胞株有如下几种来源: <?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

1. 常规体外培养的星形胶质细胞。由于其增殖周期有限，常存在复制衰老(replicative senescence)，因此难以得到高纯度的可移植细胞株。

2. 永生化星形胶质细胞株。近年来应用病毒基因的体外转导使细胞永生化，从而建立起连续传代、大量性状稳定细胞株^[14]，目前国外已成功将永生化大鼠肾上腺嗜铬细胞株移植于蛛网膜下腔用于镇痛方面的研究^[15]。国内已有报道成功构建出永生化大鼠星形胶质细胞株^[16]，后者是利用脂质体将带有嘌呤霉素筛选基因的永生化质粒转染大鼠星形胶质细胞，使转染成功的细胞获得嘌呤霉素抗性，经嘌呤霉素筛选，获得了稳定整合的猿肾病毒40大T抗原（SV40Tag）基因的阳性细胞克隆。PCR、RT-PCR结果表明SV40Tag基因已稳定地导入细胞基因组中，并存在转录水平mRNA的表达，同时SV40大T抗原和GFAP免疫化学染色阳性，保留了原星形胶质细胞的特异标记，且增殖活跃。

3. 从成体多潜能先祖细胞(MAPCs)中分化出可控性星形胶质细胞株，有资料显示，MAPCs不仅仅可以作为一种载体细胞，还同时可能作为工程细胞而形成与机体内环境相适应的神经、血管及相应的结缔组织等^[8，9]，因此推测，从MAPCs中分化出可控性星形胶质细胞株再进行移植后，最有可能建设性地整合成为较平衡的嵌合体，从而构成系统的功能性组织结构。

四、转基因神经细胞株镇痛基因表达的调控

筛选到星形胶质细胞株后，在转基因镇痛治疗方面，安全性是需要首先考虑的问题之一。要做到这一点，必须使转基因能在特定细胞中的表达受到精确的控制。外源性镇痛基因的表达如果不受控制，要么表达量过少无镇痛效能，要么持续表达可能会造成严重机能紊乱。

能调控转基因神经细胞株中镇痛基因的表达，得益于基因工程技术的迅速发展。近年来，调控镇痛基因表达的方法有如下几种:

1. 细胞的永生化和去永生化技术。1999年，Eaton等将谷氨酸脱氢酶(GABA的合成酶)的编码基因GAD67cDNA体外转染到条件永生化的大鼠脑干神经元，得到了阳性表达细胞^[17]，而当这些编码GAD基因的细胞被移植于慢性疼痛模型动物的蛛网膜下腔2周后，开始出现明显的抗伤害效应，其作用高峰时间在2～3周，作用持续7周以上，这一研究将永生化技术成功引入到了镇痛领域。随着对永生化大鼠星形胶质细胞株的生物学特性的进一步研究，将为建立外源基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株用于细胞移植镇痛方面的研究奠定良好的基础。

2. 新近发展的具有严密开/关功能的基因表达系统即Tet-on & Tet-off真核基因表达系统，其外源基因的表达严格地受调节因素四环素的控制，为开发基因治疗手段提供了新的手段^[18]。Tet-off系统在没有四环素(Tet) 或其衍生物强力霉素(Dox)存在的条件下，引起插入启动子下游的外源基因的持续高效表达，随四环素浓度的增加，基因表达以一种剂量依赖性的模式逐渐关闭至零。而Tet-on系统则刚好相反，外源基因的表达随四环素浓度的增加达到最大。有学者运用“基因开关”模型，精确调控转基因自体细胞移植的胰岛素分泌，在糖尿病的治疗中取得了可喜的成果^[19]，该技术在细胞镇痛领域的研究正在进行之中，此研究将填补可控性转基因细胞镇痛这一空白领域，并为将来开发能感知患者疼痛程度并按需释放镇痛物质的“智能型镇痛生物微泵”积累经验。

3. 有关成体多潜能先祖细胞(MAPCs)的研究提示，应用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子诱导MAPCs分化的星形胶质细胞株后，通过外源镇痛基因的修饰可获得颇具发展潜力、安全无致瘤性、功能完善的转基因镇痛细胞株。

五、展 望

综上所述，干细胞分化为神经细胞的可控性逐渐被人们所认识，选择性地应用转基因星形胶质细胞株移植镇痛有可能是治疗慢性顽固性疼痛的一个新方法。目前的研究工作仅仅是神经细胞移植镇痛的开端，随着干细胞可控性分化机理研究的进一步深入，干细胞领域更多研究成果有望应用于临床疼痛性疾病细胞水平和基因水平的治疗。

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