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RNA干扰技术抑制Nav1.8基因表达在疼痛研究中的应用
时间：2010-08-23 14:33:02 来源： 作者：
| 方法：(1) 建立足底注射角叉菜胶致大鼠炎性痛模型和胫骨内注射walker256肿瘤细胞致大鼠骨癌痛模型，Von-Frey filaments和CO2激光热刺激仪测定触诱发痛和热痛敏阈值，观察大鼠痛敏阈值降低的发生及持续时间，并通过病理切片观察肿瘤细胞在骨癌痛模型大鼠胫骨内的生长情况。利用RT-PCR和荧光定量PCR的方法检测两种疼痛模型大鼠L5～6 DRG Nav1.8的表达。(2) 根据RNA干扰的原理，设计2个以Nav1.8 mRNA为靶点的SiRNA（SiRNAa和SiRNAb）及1个阴性对照RNA，并于T7 RNA聚合酶的作用下体外转录合成。阳离子脂质体转染试剂将SiRNA导入原代培养DRG神经元，应用荧光标记的阴性对照RNA（化学合成）估计SiRNA的转染效率。于转染后48h提取RNA，RT-PCR和荧光定量PCR检测SiRNA诱导的Nav1.8基因沉默效果。(3) 化学合成以Nav1.8为靶点的SiRNA及阴性对照RNA并进行3’端的甲基化修饰。大鼠经腰骶部鞘内置管后，分别给予鞘内注射SiRNA25µg、50µg、100µg，阴性对照RNA 100ug，或生理盐水10ul，连续3d。最后一次给药后24h，于左侧足底注射角叉菜胶，观察SiRNA对炎症刺激大鼠疼痛反应的影响；鞘内注射SiRNA 50µg/d，持续3d，最后一次给药后24h，冰上取大鼠L5～6 DRG，RT-PCR及荧光定量PCR检测Nav1.8 mRNA表达水平。 结果：(1) 足底注射角叉菜胶致大鼠痛阈降低，持续时间至48h仍未见明显缓解。胫骨内接种Walker256肉瘤细胞后7～14d大鼠出现痛阈降低，胫骨病理切片证实肿瘤细胞在骨髓腔内浸润性生长。炎性痛和骨癌痛模型大鼠DRG Nav1.8 mRNA表达均升高。(2) 在设计的两个针对Nav1.8基因的SiRNA中，SiRNAa转染DRG神经元后 Nav1.8表达降低(48.32±6.84)%，SiRNAb可使Nav1.8表达降低(23.32±3.19)%，阴性对照RNA对Nav1.8的表达不产生影响。通过荧光标记的阴性对照RNA观察到本试验所用转染条件下，转染效率可达30～50%。(3) 鞘内注射针对Nav1.8基因的SiRNA（50µg和100µg）可有效缓解角叉菜胶所致炎性痛，SiRNA 25ug组、阴性对照RNA及生理盐水对炎性痛大鼠的疼痛阈值均无明显影响。鞘内注射SiRNA可显著降低DRG Nav1.8 mRNA表达水平，阴性对照RNA对Nav1.8 的表达无明显影响。SiRNA或阴性对照RNA均不影响DRG GAPDH基因的表达和大鼠基础痛阈值。 结论：(1) 炎性痛及骨癌痛模型大鼠背根神经节Nav1.8 表达上调，提示该通道参与炎性痛及骨癌痛的发生过程；(2) SiRNA转染体外培养DRG神经元可干扰Nav1.8基因的表达，证明RNAi技术在神经元内源性基因的表达沉默研究中具有可行性；(3)鞘内注射SiRNA可诱导背根神经节Nav1.8基因的表达抑制，并有效缓解角叉菜胶所致炎性痛，表明Nav1.8参与炎性痛的发生，以该基因为靶点的SiRNA有望为疼痛治疗提供新的方法。 |
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