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人前脑啡肽原基因修饰永生化大鼠神经前体细胞株的构建
时间：2010-08-23 14:34:11 来源： 作者：
| 目的： 将携带人前脑啡肽原（human preproenkephalin, hPPE）的重组腺相关病毒2型（recombinant adeno-associated virus type 2, rAAV2）rAAV2/hPPE转染永生化神经前体细胞（INPC），从而获得高表达亮氨酸脑啡肽的转hPPE永生化神经前体细胞株，为下一步转基因细胞移植镇痛研究打下基础。 方法： 携带hPPE的载体rAAV2/hPPE和含有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）的对照载体rAAV2/eGFP分别转染INPC，转染rAAV2/eGFP 12h后开始应用倒置荧光显微镜观察转rAAV2/eGFP INPC绿色荧光蛋白的表达，并计算转染效率，应用巢蛋白抗体和猿肾病毒40抗体进行细胞鉴定。5%胎牛血清诱导转rAAV2/hPPE INPC分化后，应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力。采用免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法检测转染细胞hPPE、亮氨酸脑啡肽（Leu-enkephalin, L-EK）的表达与分泌。 结果： INPC转染rAAV2/eGFP 12h后即有绿色荧光蛋白表达，转染72h后，大部分细胞表达绿色荧光蛋白，转染效率可达90%。免疫细胞化学结果显示INPC转染rAAV2/hPPE后nestin和SV40抗体染色均为阳性，且可被血清诱导分化为神经元和星形胶质细胞。免疫细胞化学法、RT-PCR和放射免疫法结果均表明转rAAV2/hPPE永生化神经前体细胞hPPE的表达与L-EK的分泌均明显高于未转染细胞（P<0.01）。 结论： 成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠神经前体细胞，命名为INPC/hPPE，hPPE基因可以在神经前体细胞中稳定表达，腺相关病毒介导的hPPE表达对细胞本身的生长特性无明显影响，INPC/hPPE在体外培养条件下可持续分泌较高水平亮氨酸脑啡肽，这确保了该细胞用于下一步转基因细胞移植镇痛研究的可行性。 |
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