[Abstract]  Objective  To study the protection of Inhibitors of protein tyrosine kinases on ventilator-induced lung injury. Method  Thirty healthy male SD rats were divided into three group(A、B、C group, n=10). All groups performed  mechanic ventilation. A group: tidal volume(V_T) =8ml/kg, breathing rate(p)=80/min; B group: tidal volume(V_T)=40ml/kg, breathing rate(p)=80/min; C group: tidal volume(V_T)=40ml/kg, breathing rate(p)=80/min. all rats in C group were intraperitoneally injected genistein(50mg/kg). The time of ventilation in all groups is two hour. Rats were sacrificed after experiment was finished. The lung lavage liquid and lung tissue were collected and stored with correct methods. The measured indexes include total protein、W/D、WBC、MPO and TNF-a. Lung pathological change was observed by microscope; Lung cell apoptosis was examined with TUNEL. Results  Compared with A group, total protein、W/D、WBC、MPO、TNF-a and Lung cell apoptosis significantly increased in B group（p<0.01）; Compared with B group, the indexes above significantly decreased in C group（p< 0.05）. Conclusion  Genistein can significantly alleviate ventilator induced lung injury.

 [Keyword]  Ventilator-induced lung injury; mechanical ventilation

    呼吸机所致的肺损伤（Ventilator-induced lung injury, VILI）是肺功能严重受损的病人行机械通气支持治疗时的常见并发症，近些年来成为研究的热点。其主要致病机制之一可能是由于过度的机械刺激（如牵拉、切变力等）激活了肺细胞内多种和炎症密切相关的信号转导通路，如p38、JNKs通路以及NF-kB系统等多种信号转导通路的激活，使各种致炎因子的表达增多，引起白细胞（特别是中心粒细胞）在肺组织“募集”，从而造成肺损伤^[1,2,3]。蛋白酪氨酸激酶是机体的一类重要的激酶，在各种信号转导通路的激活中发挥着重要的作用。金雀异黄素（Genistein）是一种非特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂，能显著抑制受体型蛋白酪氨酸激酶和非受体型蛋白酪氨酸激酶的激活(即磷酸化)^[4]。近来研究证明，Genistein能显著减轻内毒素诱导的急性肺损伤模型，减轻肺组织急性炎症反应的程度^[5]。在本研究中，我们利用大鼠VILI实验模型，研究Genistein对大鼠VILI的保护作用。

材料与方法

主要试剂  ELISA试剂盒和金雀异黄素（Genistein）购自深圳晶美生物工程有限公司，TUNEL分析试剂盒为武汉博士德公司提供，总蛋白和MPO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

动物与分组  30只健康SD大鼠随机均分成A、B、C三组，每组各10例。A组为小潮气量通气组，潮气量（V_T）＝8 ml/kg，呼吸频率（P）＝80次/min，PEEP＝0；B组为损伤组，行大潮气量机械通气，潮气量（V_T）＝40 ml/kg，呼吸频率（P）＝80次/min，PEEP＝0；C组为处理组，同样行大潮气量机械通气，潮气量（V_T）＝40 ml/kg，呼吸频率（P）＝80次/min，PEEP＝0，实验前1/2h腹腔注射Genistein溶液(50mg/kg)。A、B、C两组机械通气时间均为2h。

动物模型  20％乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，起效后行气管切开，插入气管导管（用16号静脉穿刺套管针外套管自制）行机械通气，机械通气参数统一设置为：潮气量(V_T)：40ml/kg或8 ml/kg，呼吸频率（RR）：80次/min，吸/呼比（I:E）为1：1，PEEP为零，吸入气体为室内空气。皮下切开行股静脉穿刺置管，静脉给阿曲库铵维持肌松。颈内动脉穿刺置管，监测动脉血压、心率等。

标本留置  机械通气达到预定时间后，放血处死大鼠。小心分离左右两侧完整肺组织，部分右侧肺组织用多聚甲醛溶液固定，用于病理切片以及细胞凋亡检测。左肺用生理盐水行肺灌洗（2ml×3次），回收的肺灌洗液应大于80％。回收后立即离心10分钟（1500g/min），沉淀物用PBS缓冲液稀释后行白细胞计数，上清于-70℃冰箱保存待检。

检测指标  对于肺组织标本，具体检测各组肺组织病理改变， TUNEL法检测肺细胞的凋亡，同时检测肺湿干重比值以及肺组织中性粒细胞髓过氧化物酶（MPO）的水平；对于肺灌洗液标本，具体检测肺灌洗液中TNF-a的水平、总蛋白浓度以及白细胞计数等。具体方法如下：

总蛋白和MPO  肺灌洗液中总蛋白的测定采用考马斯亮兰染色法，采用UV-2000型分光光度计测量吸光度；肺组织中MPO活性测定采用专用MPO试剂盒，先准确称取肺组织重量，按重量体积比用匀浆缓冲液（试剂盒中自备）进行匀浆，其后所有步骤均严格按照试剂盒进行，最后用UV-2000型分光光度计测量特定波长下吸光度。MPO活性单位定义为：每克肺组织湿片在37℃反应体系中H₂O₂被分解1umol为一个酶活力单位。

肺湿干重（W/D）比值测定:取动物一叶右肺组织，称湿重后置于烤箱中， 70℃烘烤至恒重后称干重,计算肺Ｗ/Ｄ比值。

TUNEL法检测凋亡细胞  用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的末端标记法（TUNEL法）分析肺组织中细胞凋亡的情况，通过原位测定肺组织切片中的DNA 片段对损伤的肺组织中细胞凋亡的程度进行评价。细胞核呈棕黄色染色为阳性细胞，在400 倍光镜下每张切片随机观察10个视野，计算每个高倍视野中阳性细胞数和该高倍视野中细胞总数的比值，以百分数表示，即凋亡指数（apoptosis index,AI）。

TNF-a  肺灌洗液中TNF-a的水平采用双抗体夹心ELISA法。所有操作均严格按照试剂盒说明进行，先在酶标仪上测量标准品吸光度并绘制出标准曲线，然后测量样品吸光度，并根据测得的吸光度在标准曲线上读出样品的浓度。

统计学处理  测定值用ｘ±s，用SPSS10.0软件进行单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结  果

病理学改变   A组肺组织病理改变较轻，肺泡间隔正常，偶见少量的炎性细胞以及巨噬细胞，肺泡腔无明显渗出物；B组肺组织病理改变明显，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内可见较多的炎性细胞，部分肺泡腔内有渗出液；和B组比较，C组肺组织病理改变明显减轻，肺泡间隔一定程度增厚，但轻于B组，肺泡腔可见少量炎性细胞浸润，部分肺泡腔有少量渗出物。见图1。

TUNEL检测非细胞的凋亡   TUNEL分析显示A组肺组织有少量肺细胞凋亡；B组肺组织细胞凋亡数目明显增加（P<0.01），和B组相比，C组细胞凋亡数目明显减少（P<0.01）。见图2、表1。

和A组比较，B组肺细胞凋亡数、总蛋白、W/D、白细胞计数、MPO、TNF-a值等各项指标均显著性增高（p<0.01）；和B组比较，C组肺细胞凋亡数、总蛋白、W/D、白细胞计数、MPO、TNF-a值等各项指标均显著性低于B组（p<0.05）。见表1。

参考文献

1. Liu MY, Tanswell AK, Post M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol, 1999, 277: 667-683.

2. Li LF, Quyang B, Choukroun, etal. Stretch-induced IL-8 depends on c-Jun NH2-terminal and nuclear factor-kB-inducing kinases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2003,285: 464–475.

3. Held HD, Boettcher S, Hamann L, et al. Ventilation-induced chemokine and cytokine release is associated with activation of nuclear factor-kappaB and is blocked by steroids. Am J Respir Crit Care Med, 2001 163: 711-716.

4. Akiyama T, Ishida J, Nakagawa S, et al.   Genistein, a Specific Inhibitor of Tyrosine-specific Protein Kinases. J Biol Chem, 1987, 262: 5592-5595.

5. Kang JL, Lee HW, Lee HS, et al. Genistein Prevents Nuclear Factor-Kappa B Activation and Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide. Am J Respir Crit Care Med, 2001,164: 2206-2212.

6. Xia Z, Dickens M, Raingeaud J, et al. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science, 1995, 270: 1326-1331.

7. Glenney JR Jr. Tyrosine-phosphorylated proteins: Mediators of signal transduction from the tyrosine kinases. Biochim Biophys Acta, 1992, 1134: 113–127.

8. Tamura M, Nakagawa Y, Shimizu H, et al. Cellular functions of mitogen-activated protein kinases and protein tyrosine phosphatases in ovarian granulosa cells. J Reprod Dev, 2004 ,50: 47-55.

9. Parker JC, Ivey CL, Tucker A. Phosphotyrosine phosphatase and tyrosine kinase inhibition modulate airway pressure-induced lung injury. J Appl Physiol, 1998, 85: 1753-1761.