机械通气所致的肺损伤（Ventilator-induced lung injury, VILI）是肺功能严重受损的病人行机械通气支持治疗时的常见并发症，其主要致病机制之一可能是由于过度的机械刺激（如牵拉、切变力等）激活了肺细胞内多种和炎症密切相关的信号转导通路，使各种致炎因子的表达增多，引起白细胞在肺组织“募集”，从而造成肺损伤^[1,2,3]。p38信号转导通路是和炎症反应密切相关的信号转导通路，其激活后可介导多种致炎细胞因子的表达。本研究检测了不同通气方式时p38MAPK以及多种致炎因子的表达水平，研究p38在机械通气所致肺损伤中的作用。

材料与方法

主要试剂  Trizol提取液、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、ELISA试剂盒均购自深圳晶美生物工程有限公司，总蛋白和MPO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，兔抗p38、p-p38抗体为BioVision公司产品。

动物与分组  30只健康SD大鼠随机均分成A、B、C三组，每组各10例。A组：潮气量（V_T）＝8 ml/kg，呼吸频率（P）＝80次/min，PEEP＝0；B组：潮气量（V_T）＝20 ml/kg，呼吸频率（P）＝80次/min，PEEP＝0；C组：潮气量（V_T）＝40 ml/kg，呼吸频率（P）＝80次/min，PEEP＝0。A、B、C两组机械通气时间均为2h。

动物模型  20％乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，起效后行气管切开，插入气管导管（用16号静脉穿刺套管针外套管自制）行机械通气，机械通气参数统一设置为：潮气量(V_T)同上，呼吸频率（RR）：80次/min，吸/呼比（I:E）为1：1，PEEP为零，吸入气体为室内空气。皮下切开行股静脉穿刺置管，静脉给阿曲库铵维持肌松。颈内动脉穿刺置管，监测动脉血压、心率等。

标本留置  机械通气达到预定时间后，放血处死大鼠。小心分离左右两侧完整肺组织，部分右侧肺组织用多聚甲醛溶液固定，用于病理切片检查，部分右侧肺组织直接放入液氮中保存待检。左肺用生理盐水行肺灌洗（2ml×3次），回收的肺灌洗液应大于90％。回收后立即离心10分钟（2000 r/min, r=8cm），沉淀物用PBS缓冲液稀释后行白细胞计数，上清于-70℃冰箱保存待检。

检测指标  对于肺组织标本，具体检测各组肺组织中p38、磷酸化p38（p-P38）、细胞粘附分子(ICAM－1)的水平，并检测肺组织中中性粒细胞髓过氧化物酶（MPO）的水平；对于肺灌洗液标本，具体检测肺灌洗液中TNF-a、MIP-2、总蛋白浓度以及白细胞计数等。具体方法如下：

总蛋白和MPO  肺灌洗液中总蛋白的测定采用考马斯亮兰染色法，采用UV-2000型分光光度计测量吸光度；肺组织中MPO活性测定采用专用MPO试剂盒，先准确称取肺组织重量，按重量体积比用匀浆缓冲液（试剂盒中自备）进行匀浆，其后所有步骤均严格按照试剂盒进行，最后用UV-2000型分光光度计测量特定波长下吸光度。MPO活性单位定义为：每克肺组织湿片在37℃反应体系中H₂O₂被分解1umol为一个酶活力单位。

TNF-a和MIP-2  肺灌洗液中TNF-a、MIP-2的水平采用双抗体夹心ELISA法。所有操作均严格按照试剂盒说明进行，先在酶标仪上测量标准品吸光度并绘制出标准曲线，然后测量样品吸光度，并根据测得的吸光度在标准曲线上读出样品的浓度。

逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）  肺组织中细胞粘附分子ICAM-1基因的表达水平采用RT-PCR的方法。RT-PCR具体方法如下。（一）RNA的提取。准确称取100mg肺组织，匀浆后按Trizol一步法进行RNA抽提。（二）RNA逆转录。抽取1ug总RNA，按逆转录试剂盒所提供的方法合成cDNA。（三）PCR。PCR反应体系包括：cDNA 4ul，Buffer 5ul，dNTP 1ul，引物的正义链和反义链各1ul，MgCl₂ 4ul，Taq酶1ul，加水至50ul。内参采用管家基因磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。PCR反应设定如下，先95℃预变性4－5min，然后扩增30－35个循环，每个循环包括如下步骤，变性：94℃－30s；退火：55℃－30s（GAPDH），60℃－30s（ICAM-1）；延伸：72℃－45s。最后72℃延伸7min，4℃终止反应。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统采集图像，用图像分析软件(Imagemaster)分析目的基因片段OD值。ICAM－1特异引物为，正义链：

5’ AGACACAAGCAAGAGAAGAAAAGG 3’，反义链：5’ TTGGGAACAAAGGTAGGAATGTAT 3’，目的基因片段长度为425bp； GAPDH特异性引物为，正义链：5’ TGAAGGTCGGTG－TCAACGGATTTGGC 3’，反义链：5’ CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC 3’，目的基因片段长度为983bp。

Western blot检测p38、磷酸化p38的表达  取大鼠右侧肺组织,分别剪碎,各加入一定比例裂解液 ,冰浴条件下进行组织匀浆; 4℃, 10000 r /min(r=8cm)离心,弃除沉淀,用考马斯亮蓝法定量。每份样本取等量总蛋白，10％变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳。将蛋白转移至硝酸纤维素膜后于5%的脱脂牛奶中封闭3 h,加入1∶1 000稀释的一抗(兔抗p38、p-p38抗体), 4℃过夜。膜漂洗后加入1∶2 000稀释的二抗,室温下摇床杂交1 h。ECL化学发光法检测阳性信号。采用Bio-Rad Gel Doc1000成像系统采集X线片上的试验结果图像，用图像分析软件(Image master)分析图像条带，并计算其积分光密度。

统计学处理  测定值用ｘ±s，用SPSS10.0软件进行单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结  果

病理学改变   A组肺组织无明显病理改变，肺泡间隔正常，偶见少量的炎性细胞以及巨噬细胞，肺泡腔无明显渗出物；B组肺组织可见一定的炎性损伤性改变，肺泡间隔增厚，肺泡腔内可见一定数量的炎性细胞，部分肺泡腔内有渗出液；C组肺组织病理改变明显加重，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔可见较多的炎性细胞浸润，肺泡腔有较多的渗出物。

Western Blot检测各组大鼠肺组织p38、p-p38的表达。结果表明，A、B、C三组肺组织p38的表达水平无显著性差异（p>0.05）；和A组比较，B组p-p38的表达水平显著性增高（p<001）；和B组比较，C组p-p38的表达水平也显著性增高（p<001）。图2、图3。

A组ICAM-1仅有较微弱的表达，B组的表达水平显著性增高(p<0.01)，C组ICAM-1的表达水平也显著性高于B组(p<0.01)；和A组比较，B组总蛋白、白细胞计数、MPO、TNF-a、MIP-2值等各项指标均显著性增高（p<0.01）；和B组比较，C组总蛋白、白细胞计数、MPO、TNF-a、MIP-2值等各项指标也显著性增高（p<0.05或0.01）。见图4、表1。

参考文献

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3. Held HD, Boettcher S, Hamann L, et al. Ventilation-induced chemokine and cytokine release is associated with activation of nuclear factor-kappaB and is blocked by steroids. Am J Respir Crit Care Med, 2001 163: 711-716.

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