[Abstract]   Objective   To investigate the effect of genistein pretreatment on ventilator-induced lung injury (VILI) .Methods   Thirty healthy male SD rats were used in this study. The animals were anesthetized with intraperitoneal 20% urethane, tracheotomized, intubated and mechanically ventilated for 2h. The animals were randomly divided into 3 groups (n=10 each): group A V_T =8 ml·kg^-1 ; group B V_T =40 ml·kg^-1 and group C V_T =40 ml·kg^-1 + genistein. In group C genistein 50 mg·kg^-1 was injected intraperitoneally 30 min before mechanical ventilation. The animals were sacrificed by exsanguination at the end of 2h mechanical ventilation. The lungs were removed for (1) microscopic examination, (2) broncho-alveolar lavage and determination of TNF-αand total protein concentrations in broncho-alveolar lavage fluid (BALF) and (3) determination of p38 and phosphorylated p38 (P-p38) expression and MPO activity in lung tissue. Results   Mechanical ventilation with large tidal volume (V_T ) in group B induced serious histopathologic damage and significant increase in TNF-αand total protein concentration’s in BALF and p38 and P-p38 expression and MPO activity in lung tissue as compared with group A. Genistein pretreatment significantly attenuated the changes induced by mechanical ventilation with large V_T in group C. Conclusion   Genistein 50 mg·kg^-1 pretreatment can significantly inhibit the activation of p38 and attenuate VILI.

 [Key words]  Genistein ；Respiratory,artificial；Respiratory distress syndrome,adult

对于呼吸功能严重受损的病人，机械通气是一种必不可少的治疗手段。但机械通气治疗在提供了一种有效的呼吸支持治疗的同时，还能导致肺部严重的损伤，即机械通气所致肺损伤（VILI），其主要致病机制之一可能是由于过度的机械刺激（如牵拉、切变力等）激活了肺细胞内多种和炎症有关的信号转导通路，如p38MAPK、JNKs通路以及NF-κB系统等多种信号转导通路的激活，使各种致炎因子的表达增多，引起白细胞在肺组织“募集”，从而造成肺损伤^[1-3]。蛋白酪氨酸激酶是机体的一类重要激酶，在p38、JNKs等多种信号转导通路的上游发挥着重要的调节作用。金雀异黄素是一种特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂^[4]，有研究表明，金雀异黄素能明显减轻多种原因诱导的急性肺损伤，减轻急性炎症反应的程度^[4-6]。但是金雀异黄素是否能减轻VILI尚需进一步探讨。本研究拟观察金雀异黄素预先给药对大鼠VILI的作用，为临床研究提供依据。

材料与方法

主要试剂  ELISA试剂盒和金雀异黄素（分别来自美国Biosource、Cayman公司），总蛋白和髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），兔抗p38、磷酸化（p-38)（p-p38）抗体（美国BioVision公司[MS1] ）。

动物选择与分组  体重为300－350g、健康雄性SD大鼠30只，随机[MS2] 均分为3组(n=10)，A组采用8 ml/kg潮气量机械通气；B组采用40 ml/kg潮气量机械通气；C组采用40 ml/kg潮气量机械通气，并在机械通气前30min腹腔注射金雀异黄素50mg/kg。

VILI动物模型的制备   腹腔注射20％乌拉坦麻醉大鼠后，行气管切开，插入自制气管导管行机械通气（浙江大学医学仪器厂生产的DH－150号小动物呼吸机），A[MS3] 组潮气量为8 ml/kg，B组和C组潮气量均为40 ml/kg，3组呼吸频率80次/min，吸/呼比（I∶E）为1∶1，PEEP为0，吸入气体为室内空气。常规监测动脉血CO₂分压（控制在30－50mmHg）。为了防止在大潮气量通气组（B、C组）出现过度通气导致的低CO₂血症，本研究进行了充分的预实验。在以40ml/kg潮气量通气时，根据体重适当延长气管导管和呼吸机之间连接管的长度以增加机械死腔，该方法曾在Quinn Da^[7]的研究中被描述。肌肉注射潘库溴铵3mg/kg维持肌松。颈内动脉穿刺置管，监测动脉血压、心率等[MS4] 。（回答见文章最后）

标本制备  机械通气2h，放血处死大鼠。小心分离左右两侧完整肺组织，部分右侧肺组织用多聚甲醛溶液固定，制作病理切片，另一部分右侧肺组织直接放入液氮中保存，用于测定MPO、p38、磷酸化p38(p-p38)水平；左侧肺组织用生理盐水行肺灌洗（2ml×3次），回收的肺灌洗液应大于80%，回收后立即离心10min（2500[MS5] r/min），沉淀物用PBS缓冲液稀释后行白细胞计数（WBC），上清液于-70℃冰箱保存，用于测定总蛋白及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度。

项目观察  1.肺组织常规切片，HE染色，光镜下观察肺组织病理学变化。2.采用MPO试剂盒测定肺组织MPO活性。3.用考马斯亮兰染色法测定肺灌洗液中总蛋白浓度，先准确称取肺组织重量，按重量体积比用匀浆缓冲液（试剂盒中自备）进行匀浆，其后所有步骤均严格按照试剂盒进行，最后用UV-2000型分光光度计测量特定波长下吸光度，MPO活性单位定义为：每克肺组织湿片在37℃反应体系中H₂O₂被分解1μmol为一个酶活力单位。4.采用双抗体夹心ELISA法测定肺灌洗液中TNF-α浓度，所有操作均严格按照试剂盒说明进行，先在酶标仪上测量标准品吸光度并绘制出标准曲线，然后测量样品吸光度，并根据测得的吸光度在标准曲线上读出样品的浓度。5.采用Western blot测定p38、p-p38的水平，取大鼠右侧肺组织,分别剪碎,各加入一定比例裂解液 ,冰浴条件下进行组织匀浆; 4℃下 10 000 r /min离心,弃除沉淀,用考马斯亮蓝法定量，每份样本取等量总蛋白， SDS-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜后于5%的脱脂牛奶中封闭3 h,加入1∶1 000稀释的一抗(兔抗p38、p-p38抗体), 4℃过夜。膜漂洗后加入1∶2 000稀释的二抗,室温下摇床杂交1 h。ECL化学发光法检测阳性信号。采用Bio-Rad Gel Doc1000成像系统采集X线片上的试验结果图像，用Image master图像分析软件分析图像条带，并计算其积分光密度，以p-p38积分光密度和p38积分光密度的比值（p-p38/p38）反映p38磷酸化程度。

统计学处理  用SPSS10.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差（ｘ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结  果

病理学改变   A组肺组织病理学改变较轻，肺泡间隔正常，偶见少量的炎性细胞以及巨噬细胞，肺泡腔无明显渗出物；B组肺组织病理学改变明显，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内可见较多的炎性细胞，部分肺泡腔内有血性渗出液；与B组比较，C组肺组织病理学改变明显减轻，见图1。

肺组织p38、p-p38水平的比较  3组肺组织p38及p-p38水平的Western blot 结果；3组间肺组织p38水平无差异。A组p-p38仅有微弱的表达，表现为一条较弱的条带；B组p-p38的表达明显增多，表现为一条明显加深、加粗的条带；C组p-p38表达和B组相比明显减少，表现为条带变窄，见[MS1] 图1；与A组比较，B组、C组肺组织p-p38/p38升高（P<0.01）；与B组比较，C组肺组织p-p38/p38降低（P<0.01），见表1。

与A组比较，B组、C组肺泡灌洗液总蛋白、WBC、TNF-α水平及肺组织MPO活性均升高（P<0.05）；与B组比较，C组以上各项指标均降低（P<0.05），见表2。

讨 论

本研究VILI模型的潮气量设为40 ml/kg，是参考Ricard等^[8]及Karzai^[9]的相关研究（其损伤性通气的潮气量分别为42ml/kg和40ml/kg）[MS2] 。本研究机械通气的时间设为2h，是因为预实验时发现，大鼠以40ml/kg潮气量机械通气2h时肺损伤的病理改变比较明显，而如果再延长机械通气时间有可能会提高实验中大鼠死亡率。本研究结果表明，B组肺组织病理学改变明显，表现为肺泡间隔明显增厚，部分肺泡腔内有血性渗出物，部分肺泡腔内可见较多的炎性细胞，肺灌洗液总蛋白、WBC和TNF-α水平升高，表明VILI模型建立成功。

VILI的具体机制十分复杂，包括机械伤和生物伤，前者是指在高气道压、高容积等机械刺激造成肺泡、肺毛细胞血管壁破裂、肺弥散性水肿等损伤，而生物伤是指肺部急性炎性损伤，指绝对或相对无穷大的机械通气在肺细胞表面产生过度的机械刺激，从而激活了肺细胞内多种信号转导通路，导致多种炎性因子释放而引起的肺损伤[1-3]，在各种被激活的信号转导通路中，MAPK通路的激活被认为是VILI致病机制的中心环节，MAPK通路主要包括ERK、p38、JNKs三种形式，其中p38、JNKs和炎症的关系密切。研究表明，p38通路的激活在各种急性肺部炎性损伤的致病机制中起着非常重要的作用，其激活时表现为p38发生磷酸化，形成p-p38^[10]。细胞学的研究表明，一定强度的牵张等机械刺激能迅速激活肺上皮细胞上多种蛋白酪氨酸激酶，从而介导了MAPK等多种信号通路的激活^[1,11-13]，表明蛋白酪氨酸激酶在将外界的机械刺激转化为细胞内的生物化学信号的过程中发挥着重要的调节作用。

本研究中， B组肺组织p-p38/p38水平高于A组，说明和8ml/kg潮气量机械通气相比，40ml/kg潮气量机械通气2h能激活p38通路，使p-p38水平增加，p38通路激活的程度与牵拉等机械刺激的强度有关；而C组肺组织p-p38/p38水平高于B组，但低于B组，表明金雀异黄素预先给药能在一定程度上抑制VILI时p38通路的激活，抑制p-p38的水平。金雀异黄素为蛋白酪氨酸激酶的特异性抑制剂，而蛋白酪氨酸激酶在p38等信号通路的上游起着重要的调节作用，因此金雀异黄素抑制VILI时p38通路的激活的机制可能和抑制蛋白酪氨酸激酶的激活有关。金雀异黄素抑制VILI时p38通路的激活可能会减轻VILI的急性炎性损伤，减轻VILI。研究表明，金雀异黄素可以抑制LPS诱导激活的多种蛋白酪氨酸激酶，如p56^lyn、p58^hck、p59^c-fgr等，从而抑制了JNKs、NF-κB等通路的激活，明显减轻了LPS引起的急性肺损伤^[6]。由于蛋白酪氨酸激酶种类较多，在本研究中，金雀异黄素具体通过抑制哪一种蛋白酪氨酸激酶来抑制VILI时p-p38的表达还不十分清楚。

本研究中测定了肺灌洗液MPO的活性，以MPO的活性反映肺组织中性粒细胞的浸润程度，同时测定肺灌洗液总蛋白浓度、WBC以及TNF-α的水平，以此反映肺组织炎症反应的程度，结果表明，B组肺灌洗液总蛋白浓度、WBC以及TNF-α水平升高，肺泡腔内可见较多的炎性细胞，提示大潮气机械通气激活中性粒细胞，导致中性粒细胞浸润增多，导致肺部发生炎性反应，从而导致VILI。与B组比较，C组肺组织病理改变明显减轻，肺灌洗液总蛋白浓度、WBC、TNF-α水平降低，肺组织MPO活性降低，表明金雀异黄素预先给药可抑制了中性粒细胞向肺组织的浸润、激活，减轻了肺部炎性反应，在一定减轻了VILI。金雀异黄素减轻VILI的作用可能和其抑制p38通路的激活有关。p38通路和炎症反应关系紧密，其激活后可促进各种炎性细胞因子、趋化因子和粘附分子的表达，导致白细胞向组织聚集 ^[14]。另外，由于金雀异黄素对多种蛋白酪氨酸激酶均有非特异性有抑制作用，因此其减轻VILI的作用可能和抑制其它信号转导的激活有关，如对JNKs和NF-κB的抑制作用等。

综上所述，金雀异黄素50mg/kg预先给药可减轻大鼠VILI，其机制与抑制了p38通路的激活，减轻肺部炎性反应有关。