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Protective effect of ischemic postconditioning on spinal cord ischemia2reperfusion injury in rabbits

高鹏　熊利泽　聂煌　路志红　马福成

Gao Peng ， Xiong Lize ， Nie Hua ng ， et al

Abstract

　　Objective：To evaluate the protective effect of postischemic t reatment on ischemia2reperfusion injury of the spinal cord in rabbit s.

　　Methods： Thirty male New Zealand rabbit s were ran2

domly divided into 5 groups with 6 rabbit s each ： sham group ，cont rol group ，postischemic t reatment for15 s group （PA） ，postischemic t reatment for 30 s group （PB） and postischemic t reatment for 60 sgroup （PC） . Rabbit s in cont rol group underwent occlusion of the abdominal aorta for 15 min followedby reperfusion for 48 h. In PA ，PB and PC groups ， rabbit s underwent three cycles of ischemia2reper2fusion with the duration of 15s/ 15s ，30s/ 30s and 60s/ 60s respectively just before reperfusion af ter 15min occlusion of the abdominal aorta. Motor function scores of the hind limbs and number of normalmotor neurons at anterior horn of the spinal cord were recorded at 48 h af ter the last reperfusion.

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　　Results： Motor function score of the hind limbs in PB group ^{[315（224）]} was significantly higher thanthat in cont rol group ^[2（123）] （P<0105） ，which was not significantly different among the othergroups （P>0105）.There were more normal motor neurons at anterior horn of the spinal cord in PBgroup （3617 ±710） than those in cont rol group （2517±413） （P<0101） . But there were less normalmotor neurons in PA group （1812±212） and PC group （810±411） compared with those in cont rolgroup （2517±413）（P<0105）.

　　Conclusion： The effect of ischemic postconditioning depends on thetime of postconditioning. Three cycles of 30s/ 30s ischemic postconditioning could protect the spinalcord f rom ischemia reperfusion injury ，but three cycles of 15s/ 15s and 60s/ 60s ischemic postcondition2ing exaggerate the injury.

　　Keywords： Ischemic postconditioning ；Spinal cord ischemia ； Ischemia2reperfusion injury

　　胸腹主动脉瘤手术因术中阻断主动脉，有造成脊髓缺血性损伤的危险，严重者可致截瘫^[1]。寻找有效的脊髓损伤的预防和治疗方法是目前研究的热点之一。陶凌等^[2]在兔和犬心肌缺血2再灌注模型上进行实验，发现在冠脉阻闭后再灌注前给予反复多次短暂缺血2再灌注处理，可以减小心肌梗死面积，减轻心肌缺血2再灌注损伤，提出了缺血后处理（ischemia postconditioning ，IP）的概念。我们在局灶性脑缺血模型上发现IP可以减少脑梗死容积，具有脑保护作用^[3]。本研究探讨IP是否对脊髓缺血2再灌注损伤具有保护作用。

材料与方法

　　实验动物及分组　第四军医大学动物实验中心提供的雄性新西兰大白兔30只，体重215～310kg，随机分为五组，每组6只。假手术组（N1组）仅行单纯手术操作但不阻闭腹主动脉；对照组（N2组）行单纯肾下腹主动脉阻闭15min后再灌注48h；缺血后处理A组（PA组）行肾下腹主动脉阻闭15min，再灌注前予缺血15s/灌注15s相同处理3次；缺血后处理B组（PB组）行肾下腹主动脉阻闭15min，再灌注前予缺血30s/灌注30s相同处理3次；缺血后处理C组（PC组）行肾下腹主动脉阻闭15min，再灌注前予缺血60s/灌注60s相同处理3次。PA、PB、PC三组动物均于末次缺血处理之后再灌注48h。

　　动物模型　所有动物实验前晚禁食，不限制饮水。实验当天予2％戊巴比妥钠（30～40mg/kg）静脉麻醉。术中持续输入复方乳酸钠4ml?kg－1?h－1。行股动脉穿刺，接压力传感器监测股动脉压，并从压力波形读取脉率（PR）。自肛门放入温度探头持续监测肛温，术中维持肛温于38～39℃。选取相应时间点自动脉抽取血样测定PaCO2、PaO2、pH及血糖。

　　脊髓缺血方法参照文献^[4]以及本实验室所采用的方法^[5]，取腹正中切口自剑突下两指剪开皮肤、腹膜，暴露左侧肾脏及腹主动脉，选取左肾动脉分支下1cm处阻闭腹主动脉，阻闭15min后恢复再灌注。阻闭时，以股动脉压力波形消失，压力监测值MAP≤10mmHg为准。开放时以股动脉压力波形恢复为准。

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　　后肢运动功能评分　动物于手术结束后放回笼中进行观察，自由饮食。于再灌注后48h，由一不了解分组情况的观察者进行后肢运动功能评分，评分方法采用修正Tarlov标准：0分，没有可觉察的下肢活动；1分，有可觉察的关节自主活动；2分，后肢可自由活动但无法站立；3分，可站立但无法行走；4分，后肢功能完全恢复，能正常行走。

　　病理学评估　所有动物再灌注48 h 神经功能评分结束后，采用2 ％戊巴比妥钠（30～40mg/kg）麻醉。自胸骨处剪开胸腔，暴露心脏，自主动脉根部插入灌注针头并用生理盐水1000ml灌注，继之以10％福尔马林溶液500ml滴注行组织固定。待灌注固定完毕后，自背侧暴露脊髓，并将腰膨大（L5～L7）部位脊髓组织取出，浸泡于10％福尔马林溶液中过夜。经乙醇脱水变干后，行石蜡包埋。沿冠状切面将脊髓组织切成6μm厚度切片，脱蜡膜后，常规苏木精2伊红（HE）染色。病理学改变由一不了解分组情况的观察者在200 倍显微镜下观察。损伤及坏死神经元表现为胞核固缩或溶解，胸浆呈嗜伊红染色，胞浆中尼氏体消失，有的细胞固缩红染明显。正常神经元表现为多角形结构，胞核结构清晰，胞浆中尼氏体存在。病理损伤程度通过计数脊髓前角（沿中央导水管横线以前）正常神经元数来评估。

　　统计分析　所有生理学参数以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。后肢运动功能评分采用非参数秩和Kruskal2Wallis方法检验，脊髓前角正常神经元计数采用完全随机设计的单因素方差分析法（ANOVA）进行统计。统计软件采用SPSS1210。P<0105为差异有显著意义。

结果

　　生理学指标脊髓缺血过程中血液动力学指标、直肠温度、pH、PaO2、PaCO2及血糖变化各组间差异均无显著意义。手术过程中，直肠温度保持在38～39℃之间。肾下腹主动脉阻闭前后股动脉压力变化见表1。由表中可见，行腹主动脉阻闭后，远端动脉压力均维持MAP≤10mmHg，且在各组间差异均无显著意义。

　　后肢运动功能评分术后动物均存活。再灌注48h，N2组动物后肢运动功能评分显著低于N1组（P<0101），PB组显著高于N2组（P<0105），PA、PC组与N2组比较差异无显著意义（表2）。

　　组织病理学变化再灌注48h后，N2组脊髓前角正常神经元数量显著少于N1、PB组（P<0101）；而明显多于PA、PC组（P<0105）（表3）。光镜下观察组织病理学改变，N2、PC组可见正常神经元数量明显减少，神经细胞缺血变性严重，胞浆深染、缩小，细胞核固缩，核仁消失，细胞周围有空泡形成。而PB组可见正常运动神经元较多，胞体呈多角形，核仁清晰，胞浆中尼氏体清晰。

讨论

　　本研究所采用的兔脊髓缺血模型及观察指标是目前脊髓保护和机制研究中最常用的模型和指标，行肾下腹主动脉阻闭后，远端动脉压力均维持在MAP≤10mmHg，证实此方法阻断确实，缺血效果可靠。我们采用的脊髓缺血时间为15min，这是依据预实验结果而确定的。

　　从病理学结果可以看出，缺血后处理30s/30s可以减轻脊髓缺血2再灌注损伤，而缺血后处理15s/15s和60s/60s则会加重损伤，其机制不清，需要进一步研究。

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　　关于IP的机制目前还不清楚。一些心脏方面的初步研究发现，IP作用可能与抑制凋亡^[6]、抑制氧自由基的产生^[7]或者激活腺苷受体和PI3激酶有关^[8]。孙凯等^[9]发现IP可以抑制再灌注后氧自由基过量生成而拮抗肝实质细胞凋亡的发生，从而减轻肝脏缺血2再灌注损伤。缺血2再灌注前反复、短暂的再灌2停灌相当于有控制的缓慢间歇性复氧，可以减少突然复氧时氧自由基的爆发性产生，并刺激体内抗氧化酶和自由基清除剂的释放而发挥保护效应。通过研究我们发现IP还具有脑保护作用^[3]，但具体机制尚不明确。脊髓IP保护作用的机制与心脏、肝脏或脑的机制是否相同，IP的机制是单一的还是多重的，这些都尚待进一步的研究证实。

　　脊髓缺血性损伤是胸腹主动脉瘤手术患者预后不佳的主要原因，为了避免和减轻这类损伤人们寻找了包括缺血预处理在内的很多方法。本研究结果提示IP方法也可减轻脊髓的缺血2再灌注损伤。该结果具有很大的临床实用性和应用前景，如果能在开放主动脉前进行适当的缺血2再灌注处理，就可以减轻胸腹主动脉瘤手术过程中脊髓缺血性损伤的程度，对改善预后具有积极的意义。当然动物实验研究结果要过渡到临床应用尚需更多的研究。

参考文献

1. Svensson L G， Crawford ES ， Hess KR ， et al . Experience wit h1509 patient s undergoing t horacoabdominal aortic operations. JVasc Surg ， 1993 ，17 ：3572368.

2. 陶凌，李源，高峰，等.缺血后处理对急性心肌缺血再灌注兔心脏的保护作用. 第四军医大学学报，2000 ，21 ：S1162S118.

3. 熊利泽，杨静，徐宁，等.缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响.中华麻醉学杂志，2005，25：5082510.

4. Johnson SH ， Kraimer JM ， Graeber GM. Effect s of flunarizineon neurological recovery and spinal cord blood flow in experimen2tal spinal cord ischemia in rabbit s. St roke ，1993，24 ：154721553.

5. Dong HL ，Xiong LZ ，Zhu ZH ，et al . Preconditioning wit h hyper2baric oxygen and hyperoxia induces tolerance against spinal cordischemia in rabbit s. Aneschesiology ，2002 ，96 ：9072912.

6. 李源，陶凌，臧益民，等。缺血后处理对缺血再灌注大鼠心肌梗死和心肌细胞凋亡的作用。第四军医大学学报，2002，23：169021693。

7. Zhao ZQ ，Corvera J S ， Halkos ME ，et al . Inhibition of myocardialinjury by ischemic postconditioning during reperfusion ： compari2son wit h ischemia preconditioning. Am J Physiol Heart CircPhysiol ，2003，285：H5792H588.

8. Yang XM ， Philipp S ，Downey JM ，et al . Postconditioning’s pro2tection is not dependent on circulating blood factors or cells butinvolves adenosine receptors and requires PI32kinase and guanylylcyclase activation. Basic Res Cardiol ，2005，100 ：57263.

9. 孙凯，刘志苏，孙权。缺血后处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤细胞调亡的影响。外科理论与实践，2003，6：4712474。