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高迁移率族蛋白B1在重症急性胰腺炎肠屏障损害中的作用

时间:2010-08-23 13:40:01  来源:  作者:
Role of high mobility group box-1 protein in gut mucosal barrier dysfunction during murine severe acute pancreatitis

Zheng-Gang Luan, Cheng Zhang, Chun-Lin Ge, Xiao-Chun Ma, Ren-Xuan Guo

Zheng-Gang Luan, Xiao-Chun Ma, Department of Intensive Care Unit, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Cheng Zhang, Chun-Lin Ge, Ren-Xuan Guo, Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Abstract

AIM: To investigate the role of high mobility group box-1 protein (HMGB1) in gut mucosal barrier dysfunction during murine severe acute pancreatitis (SAP) and the mechanisms.

METHODS: Rat SAP model was established by retrograde injection of 50g/L sodium taurocholate into choledochopancreatic duct. Fifty-six male health adult wistar rats were divided randomly into three groups: Control group, SAP groups, PDTC group. The concentration of plasma lipopolysaccharide (LPS) and the blood level of diamine oxidase (DAO) were determined. The expression of HMGB1 mRNA in intestinal mucosa was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and the activity of HMGB1 was determined by western blot.

RESULTS: HMGB1 mRNA levels markedly increased in intestinal mucosa at the 6 hour after SAP, peaked at 24 hours and kept relative high values up to 48 hour compared with normal control group (p<0.01). Meanwhile, HMGB1 mRNA expression was significantly inhibited by PDTC at 24 hour in intestine (p<0.01). Early treatment with PDTC could significantly reduce HMGB1 levels at 24 hour in the intestine. PDTC could alleviate the blood level of diamine oxidase and endotoxin (p<0.01).

CONCLUSION: The study suggests that the expression of HMGB1 mRNA is increased in the intestine in SAP and then the Intestinal mucosal barrier injuries are aggravated. PDTC could markly inhibit HMGB1 mRNA gene expression. PDTC attenuates gut mucosal barrier damage and endotoxemia in SAP.

Key Words: Severe acute pancreatitis; Intestinal mucosal barrier function; Pyrrolidine dithiocarbamate; High mobility group box-1 protein .

摘要
目的:探讨高迁移率族蛋白B1在重症急性胰腺炎肠屏障损害中的作用及其机制

方法:采用逆行胆胰管注射50g/L牛磺胆酸钠制备SAP大鼠模型. Wistar大鼠56只,随机分为正常对照组(Control组,n=8),SAP组(n=40), 二硫代氨基甲酸吡咯烷处理组(PDTC组,n=8). SAP组分别于建模后3、6、12、24、48h取材,PDTC组于建模后24 h取材. 测定血浆内毒素(LPS)、二胺氧化酶(DAO)水平,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肠组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1) mRNA表达,western blot法检测肠组织HMGB1水平.

结果:与对照组比较,SAP组大鼠6h 肠组织HMGB1表达显著增高,12h呈现进一步升高趋势,24h达峰值,并持续至48h,PDTC干预可显著降低肠组织HMGB1表达. PDTC组较SAP 24h组血浆内毒素、DAO显著下降(P <0.01).

结论:SAP时,肠组织内HMGB1表达上调,肠屏障损伤加重;PDTC可以明显抑制SAP时肠组织内HMGB1表达,改善肠屏障功能.

关键词:重症急性胰腺炎;肠粘膜屏障;二硫代氨基甲酸吡咯烷;高迁移率族蛋白B1

0引言
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)时肠粘膜受损伴发肠道细菌和内毒素移位是胰腺炎继发感染的根源,严重者可导致多器官功能障碍[1-2]. 近年研究发现,高迁移率族蛋白B1(high mobility group box -1 protein,HMGB1)作为晚期炎症介质参与了疾病的病理生理过程,其表达增加与脏器功能损害密切相关[3-4]. 本实验通过观察SAP时肠粘膜内HMGB-1的动态变化, 探讨HMGB-1在SAP肠粘膜屏障损害中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 牛磺胆酸钠、二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)、DAO标准品,Sigma公司;戊巴比妥钠,东北制药厂;内毒素检测试剂盒,湛江安度斯生物有限公司;RNA提取及PCR扩增试剂盒,TaKaRa公司;PCR仪及电泳仪;凝胶扫描分析系统,美国Kodak;大鼠HMGB1序列(扩增片断为680bp):上游5´-ATG GGC AAA GGA GAT CCT A-3´,下游5´-ATT CAT CAT CAT CAT CTT CT-3´[3];大鼠GAPDH序列(扩增片断为309bp):上游5´-TCC CTC AAG ATT GTC AGC AA-3´,下游5´-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3´[5];羊抗HMGB1单克隆抗体,Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG,深圳晶美公司;健康成年♂Wistar大鼠56只,体重270~330g,购自中国医科大学实验动物学部.
1.2 方法 动物分组与SAP模型制备:大鼠随机分为正常对照组(Control组,n=8),SAP组(n=40),PDTC组(n=8),SAP组分为建模后3、6、12、24、48h共5个亚组(每亚组8只). 大鼠术前12h禁食,不禁饮. 20g/L戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(1ml/kg),常规消毒后,腹部正中切口入腹腔,找到胆胰管,于其出肝门端以动脉夹暂时阻闭胆管,从乳头处的十二指肠壁进针,逆行刺入胆胰管内并固定,于胆胰管入十二指肠端用小动脉夹暂时阻闭胆胰管,以0.1ml/min速度匀速注入50g/L牛磺胆酸钠(1.5ml/kg),注射完毕后10 min去除动脉夹,逐层关腹. PDTC组于成模后即刻腹腔内注射PDTC(100mg/kg). 术后禁食,自由饮水,皮下注射生理盐水40ml/(kg•6h)行液体复苏. 正常对照组常规麻醉后取材,SAP组分别于模型成功后3、6、12、24、48h取材,PDTC组于模型成功后24h取材. 血标本的采集与处理:于上述时间点麻醉动物,腹主动脉采血,离心(3 000r/min,15min)分离血浆,分装冻存于-80℃待测. 组织标本的制备:严格无菌采取组织置于经消毒的管,液氮速冻,-70℃贮存备用.
1.2.1血浆LPS水平测定:采用动态浊度法鲎试剂检测LPS水平,所用器具经灭菌、去热源处理.
1.2.2血浆二胺氧化酶(DAO)水平测定[6-7]:血浆DAO活性按改良分光光度法测定.
1.2.3 RT-PCR方法检测肠组织HMGB1 mRNA表达:取小肠组织80mg,采用T aKaRa公司RNA提取试剂盒提取提总RNA,紫外分光光度计测定 A260:A280比值,该值稳定于1.8-2.0. 按试剂盒说明合成cDNA后取反转录产物,加入PCR反应体系,扩增目的基因. 以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参对照. 扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶用美国Kodak凝胶扫描分析系统测定积分光密度值,通过目的基因与内参对照的积分光密度比值表示mRNA表达的相对含量.
1.2.4 western blot法检测肠组织HMGB1水平:取约0.2g肠组织,4℃匀浆,加入蛋白提取液,12 000r/min,离心20min,取上清液,以考马斯亮蓝法进行蛋白定量.再将提取的蛋白等量加样,经SDS-PAGE电泳分离样品(40μg)后电转移至硝酸纤维膜上.转膜后的硝酸纤维膜经漂洗后用5%脱脂奶粉阻断非特异性结合,然后加入一抗(羊抗HMGB1单克隆抗体,Santa Cruz,浓度1∶400)4℃孵育过夜,加入标记二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG,深圳晶美,浓度1∶1000)37℃孵育1h,ECL浸膜显色.在图像分析仪上对胶片进行扫描,测定各条带的光密度值.
1.3统计学处理:所有数据均以mean±SD表示,采用单因素方差分析,经SPSS11.0统计分析软件对数据进行处理.
2 结果
2.1 血浆LPS含量变化
与正常对照组相比SAP发病后6h,大鼠血浆中LPS含量即上升,24h达峰值,48h仍显著高于正常对照组(P<0.01);PDTC干预后,大鼠血浆LPS含量显著降低(P<0.01,表1).
2.2 血浆二胺氧化酶(DAO)水平变化
在SAP组3h时血浆DAO水平较正常对照组无明显变化;在SAP建模后6h时血浆DAO水平明显上升,24h达峰,48h仍显著高于对照组(P<0.01);PDTC组较SAP 24h组血浆DAO水平明显下降(P<0.01,表1).
2.3 大鼠肠组织HMGB1 mRNA表达变化
正常对照组大鼠肠组织中HMGB1 mRNA表达微弱;SAP建模后6h,大鼠肠组织中HMGB1mRNA转录水平较正常对照组增高,12h显著升高,24h达峰值并持续至48h(P <0.01,表1,图1). 应用PDTC干预后,PDTC组大鼠肠组织中HMGB1 mRNA转录水平显著低于SAP 24h组(P <0.01,表1,图2).
2.4 肠组织HMGB1水平的变化
正常情况下大鼠肠组织中有少量的HMGB1表达,SAP模型制成6h后,大鼠肠组织中HMGB1表达开始增高,较对照组差异显著(P<0.01);12h呈现进一步升高趋势,24h达峰值,至48h仍维持在较高水平(P<0.01);给予PDTC 处理后,与SAP 24h组相比,PDTC组大鼠肠组织中HMGB1表达明显下降(P <0.01,表1,图3).

3 讨论
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一种发病凶险,并发症多,可在短时间内损伤多个脏器.近年来其救治成功率有所提高,但病死率仍为12%-15%.有并发症者可高达到50%,而其中80%的死亡原因与SAP患者肠道屏障功能受损继发感染有关[8-10]. SAP 时肠粘膜遭到破坏,肠绒毛萎缩,尖端坏死,微绒毛脱落,肠道屏障作用的削弱使肠道内细菌及其毒素易于穿透受损的粘膜上皮向肠外移位,成为继发性感染的根源[11-13].HMGB1是细胞核内一种含量丰富的非组蛋白,广泛地存在于真核细胞核中,因在电泳时快速迁移而得名,它与DNA复制、细胞增殖分化及基因转录等多种生命活动有关.研究发现HMGB1可分泌到细胞外发挥致炎效应,其产生明显晚于TNF-α、IL-1等早期炎性介质,且持续时间较长,与严重全身炎症反应综合征及多器官功能障碍等病理过程密切相关[14].新近研究表明严重创伤或感染时,组织HMGB1基因表达上调, HMGB1可介导肠屏障功能不全[15-18].
本研究结果显示,SAP时大鼠肠组织中HMGB1表达在建模后数小时内无明显变化,于建模后6h即上升,24h达峰值,48h仍高于正常,提示HMGB1可能参与了SAP肠组织损伤的病理生理过程. PDTC能够选择性地抑制NF-κB的活化[19],使用PDTC抑制NF-κB通路后,SAP大鼠肠组织中HMGB1表达明显下调,提示NF-κB可能直接或间接参与HMGB1诱生的细胞信号转导过程[20-21]. 本实验观察到,SAP大鼠肠组织HMGB1表达延迟并持续增高的同时,血浆内毒素、DAO等反映肠粘膜屏障功能的指标也不同程度的升高.给予PDTC干预后,HMGB1表达下调,肠粘膜屏障功能也得以明显改善,其机制可能为SAP大鼠应用PDTC抑制NF-κB活化后肠组织HMGB1表达受到抑制,HMGB1对肠组织的直接损伤作用减轻了[15];HMGB1与TNF-α、IL-1等早期炎性介质可相互诱导[22],NF-κB活性受抑后TNF-α、IL-1、iNOS及黏附分子等早期炎性介质表达下调进而阻断了HMGB1与早期炎性介质的相互诱导,从而改善肠粘膜屏障功能.
肠道细菌移位是SAP并发感染的主要原因, HMGB1作为晚期炎症介质在SAP肠粘膜屏障功能损害中起重要作用,通过应用PDTC可下调HMGB1水平,能有效维护肠粘膜屏障功能,为预防和治疗SAP继发肠粘膜屏障损害提供新途径.
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