您当前的位置：首页 > 主题内容 > 重症监护 > 重症治疗与护理
重症急性胰腺炎大鼠HMGB1表达与肠黏膜屏障损害的关系
时间：2010-08-23 13:41:15 来源： 作者：
| Relationship between high mobility group box-1 protein expression and gut mucosal barrier dysfunction during severe acute pancreatitis LUAN Zheng-gang1, ZHANG Cheng2, GE Chun-lin2, MA Xiao-chun1, GUO Ren-xuan2 1Department of Intensive Care Unit, 2Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of China Medical University（Shenyang 110001, China） 【ABSTRACT】 Objective: To investigate the relationship between high mobility group box-1 protein （HMGB1） expression and gut mucosal barrier dysfunction during murine severe acute pancreatitis （SAP）. Methods: Forty-eight male health adult Wistar rats were divided randomly into Control group and SAP groups. The concentration of plasma D-lactate and the activity of myeloperoxidase （MPO） in the intestinal tissue were determined. The expression of HMGB1 mRNA in intestinal mucosa was detected by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and the activity of HMGB1 was determined by Western blot. Results: Plasma D-lactate and MPO reached a peak level at 24h （16.41±4.65）μg/mL for Plasma D-lactate and（26.76±3.63）U/g for MPO respectively, （P<0.01）. Elevation of HMGB1 and HMGB1 mRNA expression in intestinal mucosa was found at 6 hour after SAP, HMGB1 and HMGB1 mRNA expression peaked at 24 hours and kept relative high values up to 48 hour compared with normal control group （P<0.01）. Conclusion: The rise of HMGB1 expression might play an important role in the intestinal mucosal barrier injuries in SAP. HMGB1 as a late mediator was involved in the pathogenesis of SAP. 【KEY WORDS】 Severe acute pancreatitis·Intestinal mucosal barrier·High mobility group box-1 protein 重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）发病凶险、并发症多、病死率高，是临床上常见的危急重症。SAP时继发肠道屏障功能衰竭，肠腔内细菌及毒素可移位至胰腺和其他脏器， 其中胰腺和胰周感染是SAP的主要死因［1-2］。有研究表明，高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）作为一种重要的晚期炎症介质，在炎症反应过程中表达升高较晚，维持时间较长，参与了感染性休克及多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）的发生、发展过程［３］。本研究通过观察大鼠SAP模型肠组织内HMGB1的变化，研究其与肠黏膜屏障损害的关系，旨在从新的角度探讨SAP肠黏膜屏障损害的发生机制。 1 材料与方法 1.1 动物分组与SAP模型制备 健康雄性Wistar大鼠48只，体重270～330 g，由中国医科大学实验动物学部提供。随机分成6组，取其中1组为正常对照组，另外5组分别为SAP建模后3、6、12、24和48 h组。大鼠术前12 h禁食不禁饮。2％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉（1 mL/kg），常规消毒后，腹部正中切口入腹腔，找到胆胰管，于其出肝门端以动脉夹暂时夹闭胆管，以5号针头注射器逆行刺入胆胰管内，于胆胰管入十二指肠端用小动脉夹暂时夹闭胆胰管，以0.1 mL/min速度匀速注入5％牛磺胆酸钠（1.5 mL/kg，Sigma公司产品），注射完毕后10 min去除动脉夹，逐层关腹。术后禁食，自由饮水，皮下注射生理盐水40 mL/（kg·6 h），行液体复苏。正常对照组麻醉后取距回肠末端10 cm左右小肠组织，SAP组分别于建模后3、6、12、24和48 h取材,部位同对照组。腹主动脉采血，离心（3 000 r/min ×15 min）分离血浆，-80 ℃冻存待测。无菌采取组织，液氮速冻，-70 ℃贮存备用。 1.2 观察指标 1.2.1 小肠髓过氧化物酶活性测定 取待测组织100 mg加0.5% HTAB 2 mL制备匀浆，超声粉碎（10 s，3次）亚细胞成分，0～4 ℃ 40 000 r/min离心15 min，取上清0.1 mL加反应液2.9 mL，保持温度25 ℃，立即于分光光度计460 nm波长下进行扫描，时长120 s。以第30 s到第90 s的吸光度的变化代表酶活力的改变。1单位小肠髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活力以25 ℃时分解1μmol H2O2来表示。所有操作均在水浴中进行。 1.2.2 血浆D-乳酸水平测定 将血浆标本0.6 mL + 50 μL高氯酸，漩涡混匀，3 000 r/min离心10 min，留取上清液0. 5 mL,加30 μL 5. 8mol/L KOH，混匀， 3 000 r /min离心10 min，除去高氯酸钾沉淀 ，留取上清液0. 4 mL，分成2管（空白管和样品测定管），各0. 2 mL。每管加pH 9. 5 甘氨酸硫肼溶液（含2 mg/mL的 NAD+ ） 0. 9 mL；样品测定管加50 μL D-LDH，空白管加50 μL水，置37 ℃水浴90 min；空白管调零后，在340 nm处测定样品测定管吸光度值［4］。根据标准管吸光度值（标准品购于Sigma公司） ，计算各样品D-乳酸浓度。 1.2.3 肠组织HMGB1水平检测 采用western blot法检测。取200 mg肠组织研磨粉碎后，加入1 000 μL新鲜配置的冷蛋白裂解液（50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5、150 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA,1% SDS），经4 ℃，12 000 r/min离心20 min，取上清液，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取40 μg蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5 min，SDS-PAGE电泳分离样品后电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭过夜，加入1:400 羊抗 HMGB1抗体（Santa Cruz）4 ℃孵育过夜后，加入二抗37 ℃孵育1 h，显色。采用凝胶成像分析系统（GDS-8000）测定各条带的吸光度值，以此代表蛋白的表达量。 1.2.4 肠组织HMGB1 mRNA的表达 取小肠组织80 mg，以异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA （TaKaRa公司试剂盒）。用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对转录产物进行扩增,以三磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehydes 3 phosphate dehydrogehase, GAPDH）作为内参对照,以目的基因与内参对照的比值为基因表达的相对含量。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后照相。大鼠HMGB1序列［5］（扩增片段为680 bp）: 5′-ATGGGCAAAGGAGATCCTA-3′（正义链）; 5′-ATTCATCATCATCATCTTCT-3′（反义链）。大鼠GAPDH序列［6］（扩增片段为309 bp）:5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′（正义链）;5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′（反义链）。 1.3 统计学处理 数据均以x±s表示，SPSS 10.0统计分析软件进行处理，采用单因素方差分析和q检验， P≤0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 血浆D-乳酸水平变化 SAP 3 h时血浆D-乳酸水平较正常对照组上升不明显；在SAP建模后6 h时血浆D-乳酸水平（9.72±3.26） μg/mL，与正常对照组（3.94±1.51） μg/mL比较，明显上升，P<0.01；SAP 24 h时达最高值（16.41±4.65） μg/mL，48 h时仍显著高于对照组（表1）。 2.2 肠组织MPO活性变化 正常对照组大鼠肠组织MPO活性较低，SAP 6和12 h时其活性均显著高于正常对照组（P<0.01）。SAP大鼠肠组织MPO活性于24 h时达最高值，并持续至48 h（见表1）。 2.3 肠组织HMGB1水平的变化 正常情况下大鼠肠组织中有少量的HMGB1表达。与正常对照组相比，SAP组肠组织中可见HMGB1表达增高。SAP 6 h肠组织中HMGB1表达明显增高，12 h呈现进一步升高趋势，24～48 h维持在较高水平（见表1、图1）。 2.4 大鼠肠组织HMGB1 mRNA表达变化 正常情况下大鼠肠组织有较低的HMGB1 mRNA表达，与正常对照组比较，SAP 6 h和12 h肠组织中HMGB1 mRNA表达增高，SAP 24 h时肠组织HMGB1 mRNA表达明显增高并持续至48 h（见表1、图2）。 3 讨论 SAP时肠黏膜屏障功能受到损害，导致细菌和内毒素的移位，从而引发肠源性感染和内毒素血症，严重时可促使多器官功能衰竭发生［７］。Ammori等［８］发现SAP患者肠黏膜通透性明显增加。SAP时肠黏膜屏障受到损害，主要通过肠系膜淋巴结—胸导管—体循环途径发生细菌及内毒素移位，细菌移位至胰腺可导致胰腺坏死组织继发感染，进入血循环可进一步刺激活化单核巨噬细胞，释放更多的细胞因子和炎性介质，从而发生全身炎性反应综合征，进一步诱发MODS，最终导致死亡。HMGB1较TNF-α、IL-1β等早期炎症介质分泌延迟且持续时间较长,故被称作“晚期”炎症介质［５，９］。HMGB1为细胞核内非组蛋白,在创伤应激或严重感染、脓毒症等病理情况下可大量表达并分泌至胞外,参与了脏器损伤过程［１０-１１］。 本研究结果显示，SAP建模后6～12 h，大鼠肠组织中HMGB1表达才明显增高，于SAP建模后24 h，大鼠肠组织中HMGB1水平达峰值并持续至48 h。有资料表明HMGB1呈时间-剂量依赖性增加肠上皮通透性［１２］，而这必将加剧肠源性细菌与内毒素移位。在SAP大鼠肠组织HMGB1延迟并持续增高的同时，反映肠组织炎症细胞浸润程度的MPO活性亦显著的升高，说明SAP大鼠肠组织中有大量中性粒细胞浸润和过量的活性氧自由基生成。当肠道屏障通透性增加，肠道中细菌产生的D-乳酸可吸收入血，因而血中D-乳酸水平升高可反映肠黏膜损伤程度和通透性的改变。本研究结果显示，随着HMGB1表达的升高，SAP大鼠血浆D-乳酸水平持续升高，提示肠黏膜通透性持续增加。因此，我们推测SAP时，大鼠肠组织HMGB1表达上调在肠黏膜损伤中具有重要意义。SAP时TNF-α、IL-1β等早期炎症介质迅速合成释放，但是难以做到早期预防性治疗。本研究结果显示, SAP时HMGB1作为晚期炎症介质介导了肠黏膜屏障功能不全的发生与发展。 【参考文献】 [1] Garside P, Millington O, Smith KM. The anatomy of mucosal immune responses[J]. Ann N Y Acad Sci, 2004,1029: 9-15. [2] Gloor B, Muller CA, Worni M, et al. Late mortality in patients with severe acute pancreatitis [J]. Br J Surg, 2001, 88（7）:975-979. [3] Wang H, Yang H, Tracey KJ. Extracellular role of HMGB 1 in inflammation and sepsis[J]. J Intern Med, 2004,255（3）:320-331. [4] Szalay L, Umar F, Khadem A, et al. Increased plasma D-lactate is associated with the severity of hemorrhagic/traumatic shock in rats[J]. Shock, 2003,20（3）:245-250. [5] Wang H, Bloom O, Zhang M, et al. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J]. Science, 1999,285（5425）:248-251. [6] Liu SF, Adcock IM, Old RW, et al. Lipopolysaccharide treatment in vivo induces widespread tissue expression of inducible nitric oxide synthase Mrna[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1993,196（3）:1208-1213. [7] Butturini G, Salvia R, Bettini R, et al. Infection prevention in necrotizing pancreatitis: an old challenge with new perspectives[J]. J Hosp Infect, 2001,49（1）:4-8. [8] Ammori BJ, Fitzgerald P, Hawkey P, et al. The early increase in intestinal permeability and systemic endotoxin exposure in patients is not associated with systemic bacterial translocation olecular investigation of microbial DNA in the blood[J]. Pancreas, 2003,26（1）:18-22. [9] Yang H, Wang H, Tracey KJ. HMG-1 rediscovered as a cytokine[J]. Shock, 2001,15（4）:247-253. [10] Wang H, Yang H, Czura CJ, et al. HMGB1 as a late mediator of lethal systemic inflammation[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2001,164 （10 Pt 1）: 1768-1773. [11] Abraham E, Arcaroli J, Carmody A, et al. HMG-1 as a mediator of acute lung inflammation[J]. J Immunol, 2000,165（6）: 2950-2954. [12] Sappington PL, Yang R, Yang H, et al. HMGB1 B box increases the permeability of Caco-2 enterocytic monolayers and impairs intestinal barrier function in mice[J]. Gastroenterology, 2002,123（3）:790-802. |
|
|
[!--temp.pl--]