Page 15 - 麻醉与监护论坛2015年第10期
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Laboratory and Clinical Investigation
内皮生长因子(VEGF)、大鼠胰岛素样生长因子1(IGF-1) 1),检测方法参照试剂盒说明书进行。将收集培养基后的
大鼠转化生长因子α(T G F-α)E L I S A检测试剂盒(凯诺公 细胞立即消化并进行计数,将E L I S A检测结果以单位体积
司),FITC标记的小鼠抗CD45单克隆抗体、PE标记的小鼠抗 细胞数量校正即为条件培养基中生长因子的浓度值(n g/106
CD90单克隆抗体。 cells)。
3.方法 4.统计学处理
(1)大鼠BM-MSCs的分离与培养 应用S P S S18.0统计软件分析,计量资料以x±s表示,采
完整提取W i s t a r大鼠大鼠双后肢(双侧胫骨、股骨), 用方差分析进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。
无菌条件下暴露骨髓腔。用含10%胎牛血清的D M E M/F-12培养 二、结果
基反复冲洗骨髓腔,将冲出来的骨髓收集于培养皿中,稀释 1.MSCs培养
至5m l,置于37℃、体积分数5%C O2细胞培养箱内培养,此细 骨髓冲洗液培养3d,换液后于倒置显微镜下可见培养瓶
胞记为P0代。此后每2-3天换液一次。细胞长满瓶底80%时按 底部散在贴壁细胞生长,胞体呈梭形、多角形以及不规则形
1∶2的比例传代。 状分布,约10~15d后细胞呈漩涡状排列。见图1。传代培养
(2)MSCs细胞表型的鉴定 至P3代后显微镜下细胞基本呈均一的梭形细胞生长,细胞形
取P3代细胞,用P B S配成细胞悬液,细胞计数为1×106/ 态未见明显变化。见图2。
L;分别以小鼠抗C D45单克隆抗体和小鼠抗C D90单克隆抗体
进行标记,流式细胞仪进行检测。 图1 P0代BMSCs培养第10天(×100)
(3)肠道缺血再灌注模型的制备 Figure 1 The 10th day of BMSCs culture in P0 (×100)
W i s t a r大鼠适应性喂养7d后进行试验。给予麻醉、固
定、备皮,腹部正中切口,充分分离肠系膜上动脉,于血管 图2 P3代BMSCs培养第5天(×100)
根部用无损伤血管夹夹闭,30m i n后,后重新打开肠系膜上 Figure 2 The 5th day of BMSCs culture in P3 (×100)
动脉,逐层缝合腹壁,给予禁食,可饮水。
(4)条件培养基的制备 2.MSCs的表型检测
将肠道缺血再灌注处理后12h的大鼠处死,距幽门10c m P3代细胞经流式细胞仪检测提示表达C D45阳性率为
处将空肠远端游离并剪取约20c m肠道,以生理盐水将肠管内 1.3%、C D90阳性率为98.6%,见图3、4。符合骨髓间充质干
粘液冲净,将肠管纵向剖开,用洁净载玻片仔细刮取肠道黏 细胞的特征。
膜层上皮组织,称重,取0.5g黏膜组织加入10m l P B S溶液后
匀浆,1000r/m i n离心10m i n,取上清液,用0.22μ m细菌过
滤器将上清液过滤,得到无菌的肠上皮黏膜的提取物。将提
取物与含10%胎牛血清的D M E M/F-12培养基按照1:4的比例混
合,得到实验组的培养基;用同样的方法取正常W i s t a r大
鼠的肠上皮黏膜无菌提取物,将提取物与含10%胎牛血清的
D M E M/F-12培养基按照1:4的比例混合,制成对照组的培养
基。
以无菌P B S溶液与10%胎牛血清的D M E M/F-12培养基按照
1:4的比例混合,得到空白组的培养基。
(5)实验分组
将生长良好的P3代的B M-M S C s分别接种至多孔培养皿
中,每孔细胞计数为1×106个,建立如下分组:①实验
组:用混有缺血再灌注损伤肠黏膜提取物的培养基孵育B M-
M S C s,共9孔;②对照组:用混有正常大鼠肠黏膜提取物的
培养基孵育B M-M S C s,共9孔;③空白组:用10%胎牛血清的
DMEM/F-12培养基孵育MSCs共9孔。将三组细胞置于37℃、体
积分数5%CO2细胞培养箱内培养。
(6)留取标本和指标检测
分别留取接种至培养皿之前的试验组、对照组、空白组
的条件培养基,作为第0天的标本,置入-20℃冰箱中保存
待测,细胞计数取1×106;E L I S A法分析第0小时和第24小时
三组培养液中转化生长因子-α(T G F-α),血管内皮生长因
子(VEGF),成纤维细胞因子(FGF),胰岛素样生长因子-1(IGF-
Laboratory and Clinical Investigation 54 FAM 2013 Jan/Feb Vol.20 Issue 1
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