Page 25 - 麻醉与监护论坛2016年第3期

Laboratory and Clinical Investigation

cell layer of hippocampus CA1 area,S100B was mainly expressed radioactively in hippocampal CA1 area.Compared with group
SH,the immunoflurescence expressions of HMGB1,S100B,RAGE and positive cells count of group BI significantly increased on
the 1st,3rd,5th day after operation(P<0.01),and decreased to the level of group SH on the 7th day.

Conclusion: Brain ischemia induced cognitive dysfunction may be related to the HMGB1/RACE and S100B/RAGE expression

in hippocampus.
Key Words. Brain Ischemia;Cognition Disorders;High Mobility Group Proteins;S100 Proteins;Advanced;Glycosylation

End Products

脑缺血可引起血管性认知功能障碍(vascular cognitive 置于4℃冰箱过夜。经T B S T漂洗3次后，把膜转移到装有相应
i m p a i r m e n t)[1]。炎性反应是认知功能障碍的病理生理机制 的酶联二抗的小盒中(1:1000，G e n e T e x，美国），显色，曝
之一[2]。损害相关模式分子(damage associated molecular 光，显影，定影。以β-actin作为内参。采用ScionImage软
p a t t e r n s,D A M P s)是在机体应激的情况下由损伤或者激活的 件定量分析积分光密度值。以目的蛋白条带积分光密度值与
细胞释放的一组重要的免疫炎性因子，可作为内源性危险信 β-a c t i n条带积分光密度值的比值反映目的蛋白的表达水
号调节无菌性炎性反应。S100蛋白超家族和高迁移率族蛋白 平。
B1(H M G B1)是D A M P s的其中成员，均可与糖基化终末产物受体
(recepter for advanced glycation endpro ducts,RAGE)结 分别于上述时点认知功能测试结束后，处死3只大鼠，
合，结合后可激活信号转导级联，上调与炎性反应有关的细 腹腔注射水合氯醛3.0m l/k g麻醉下，用肝素化的0.1m o l/
胞因子[3,4]。DAMPs/RAGE是否参与脑缺血引起的血管性认知功 L P B S经心脏灌注，随后用4%的多聚甲醛进行灌注固定，
能障碍目前尚不清楚。本研究拟评价H M G B1、S100B和R A G E的 取脑组织，制备冰冻切片。将切片放入细胞培养皿中，用
表达与大鼠脑缺血后认知功能障碍发生的关系。 0.01mol/L PBS漂洗5min×3次。加入0.3% Triton X-100溶
液，室温摇床30min，用0.01mol/L PBS漂洗5min。加入3%BSA
一、材料与方法 f r a c t i o n V溶液，室温封闭1h，吸干多余的液体，滴加用
3% BSA fraction V溶液稀释的兔抗HMGB1多克隆抗体(稀释度
1.实验动物分组 1:100)、兔抗S100B多克隆抗体(稀释度1:100)和羊抗R A G E重
健康雄性S P F级S D大鼠48只，3-4月龄，体重250-300G， 组蛋白(30μ g/m l），4℃孵育过夜。用0.01m o l/L P B S漂洗
由武汉大学动物中心提供。采用随机数字表法，将其分为２ 10min×3次，加入用驴血清稀释的偶联Alexa Fluor-555的驴
组(n=24)：假手术组(SH组)和脑缺血组(BI组)。 抗兔荧光二抗(稀释度1:150)和偶联Alexa Fluor-488的驴抗
2.实验模型制作 山羊荧光二抗(稀释度1:150)，室温下孵育2h。用0.01m o l/
腹腔注射10%水合氯醛3.0ml/kg麻醉下，仰卧固定大鼠， L PBS漂洗10min×3次。贴片，用封片剂封片，放入冰盒里，
以保温板保温，颈正中切口，钝性分离颈总动脉(C C A)，避 荧光共聚焦显微镜下观察H M G B1、S100B和R A G E共表达情况。
免损伤迷走神经和交感神经干，将4号线穿于双侧C C A；同时 H M G B1和S100蛋白呈红色，R A G E蛋白呈绿色，H M G B1/R A G E和
枕部切口暴露第一颈椎翼小孔，电凝双侧椎动脉，造成永久 S100B/RAGE共表达呈黄色。
性闭塞。24h后B I组以4号线双重结扎C C A，造成明显的脑缺
血，建立脑缺血模型；S H组仅穿线，不结扎，不电凝双侧 5.统计学处理
椎动脉。大鼠手术期间保留自主呼吸，维持直肠温度36.5- 采用P r i s m 5.0统计学软件进行分析，计量资料采用均
37.5℃。 数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，
3.认知功能检测 P<0.05为差异有统计学意义。
分别于术后1、3、5和7d时，每组取6只大鼠，采用Ｙ型
迷宫（张家港生物医学器械厂）测定大鼠的认知功能。记录 二、结果
正确反应次数和全天总反应时间（指全天完成10次反应中包
括正确反应次数和错误反应次数所需的时间）。 1.认知功能检查结果
4.指标检测 与S H组比较，B I组术后1、3、5和7d时正确反应次数减
分别于上述时点认知功能测试结束后，取３只大鼠，腹
腔注射10%水合氯醛3.5m l/k g麻醉下，取双侧海马，制备组 少，全天总反应时间延长(P<0.05)，见表1。
织匀浆，裂解后，提取蛋白。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓
度。取蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，湿法电转 表1 两组大鼠不同时点正确反应次数和全天总反应时间的比较
至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，加入合适浓度的一 (n=6,x±s)
抗(H M G B1兔多克隆抗体：1:1000，A b c a m公司，美国；S100B
兔多克隆抗体1:500，E p i t o m i c s公司，美国；R A G E兔多克 正确反应次数（次） 全天总反应时间（s）
隆抗体1:500，Cell Signaling Technology公司，美国），
组别 术后1d 术后3d 术后5d 术后7d 术后1d 术后3d 术后5d 术后
7d

SH组 9.0±1.1 9.1±1.2 9.3±1.1 9.2±1.2 131±21 132±21 132±23 131±
27

BI组 6.0± 6.1± 6.6± 6.8± 265± 266± 261± 262±
1.3a 1.4a 1.5a 1.6a 40a 39a 44a 41a

与SH组比较，aP<0.05。

2.海马HMGB、S100B和RAGE蛋白表达

Laboratory and Clinical Investigation 54 FAM 2016 Jan/Feb Vol.23 Issue 1
123