Page 22 - 麻醉与监护论坛2016年第3期
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Review and CME Lecture

     1.材料                                                             性。以P<0.05差异有统计学意义。
     D M E M/F12培养基购自Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ公司；胎牛血清购自
Sigma公司；Adv-ILK、Adv-GFP、Adv-ILK－siRNA，购自北                                 二、结果
京诺赛公司。
     2.间充质干细胞(MSCs)的分离、纯化、扩增培养和                                            1.ILK提高移植后MSCs在梗死后心肌细胞的生存率
腺病毒转染                                                                      细胞移植第４天大鼠心脏切片可观察到表达D A P I标
     无菌条件下采集16-18周龄W i s t a r大鼠的双侧胫、股骨                               记的存活细胞，呈集落或团状分布，细胞排列无规律，
骨髓，密度梯度法分离MSCs，以细胞数1×105个/ml密度接种                                      I L K-M S C s组存活细胞数目[（245±18）个]显著多于G F P-
于塑料培养瓶，D M E M/F12＋20%胎牛血清37℃、5%C O2条件下                               M S C s[（76±9）个]与I L K-s i R N A-M S C s[（18±6）个]组
培养，细胞培养至70%-80%汇合时，更换无血清培养基；按                                         （P<0.05）；对照组未见DAPI标记的细胞（图1）。
感染复数值２００分别加入A d v-I L K、A d v-G F P、A d v-I L K－                           2.ILK-MSCs移植后对梗死后心脏血管新生的影响
siRNA，37℃ 孵育2H加入新鲜的培养基，5%CO2、37℃条件下                                        移植3周后，P B S组梗死区周边可见少量新生血管
培养。                                                                   [（380±85）个]，G F P-M S C s移植组梗死区周边新生血管数
     3.心梗模型的制备与细胞移植及分组处理                                              目明显增多[（946±124）个]，尤以G F P-M S C s移植组增多
     给大鼠联合20%乌拉坦(150m g/k g）与1.5%戊巴比妥                                 明显[（1680±152）个]（P<0.05）；I L K-s i R N A-M S C s移植
(10m g/k g)腹腔注入麻醉，呼吸机正压辅助呼吸；于大鼠左                                      组新生血管数目明显减少[（421±98）个]（P<0.05）（图
侧第四肋间横切口开胸，暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆                                            2）。
锥与左心耳交界稍下1-2m m处用5-0无损伤线结扎左冠脉前降
支，造成心梗。筛选成功心梗模型大鼠36只，分成3组，每                                             图1 ILK增加移植后MSCs在梗死后心肌细胞的生存率
组12只。于大鼠心梗后1h，直视下于梗死心肌周围用微量
注射器分５点分别注射M S C s、G F P-M S C s、I L K-s i R N A-M S C s                图2 ILK-MSCs移植增加梗死后心脏血管新生
（5×106_cells/100μl）[5]，关胸，维持辅助呼吸至自主呼
吸恢复，送回笼中精心饲养。注射PBS为对照组。                                                    3.ILK-MSCs移植后对心室功能及心肌纤维化的影响
     4.移植后MSCs计数                                                           与G F P-M S C s组相比，对照组左室舒张末期内径和左室收
     取接受细胞移植第4天大鼠（每组5只）心脏标本，液                                         缩末期内径显著延长，短轴缩短率下降，心功能明显恶化
氮冷冻固定后期切片，荧光显微镜高倍镜下（×400）计数                                           （Ｐ＜０．０５）；I L K-M S C s组各项指标均有明显改善。
DAPI标记的MSCs，每只大鼠观察8张切片，取其平均值。                                         I L K-s i R N A-M S C s组与对照组相比无显著差异（图３Ａ）。
     5.毛细血管密度的测定
     细胞移植４周后，取梗死区周边组织，O C T聚合物包埋                                       图3 ILK-MSCs移植后对心室功能及心肌纤维化的影响
后，迅速在液氮中冷冻并储存于-80℃冰箱。心脏组织切成
6μ m切片，将切片与C D_34多克隆抗体孵育1h后P B S洗涤3                                   M a s s o n染色显示：对照组残留心肌数目减少、排列紊乱，
次，再将切片与适当的二抗孵育30m i n后P B S洗涤3次，水性                                    细胞坏死后形成大量胶原纤维，梗死面积为（39.7±4.5）
封片剂封片。每张切片随机取5个200倍视野，计算每个视野                                          %；G F P-M S C s组梗死区心肌细胞数目明显增多，胶原纤维
内毛细血管的数目，取平均值即为毛细血管密度。
     6.大鼠心功能的检查
     细胞移植第7天后常规做超声检查，用高频探头，经
胸前壁于大鼠胸骨左缘用二维切面超声进行检查，测量
左室收缩末期内径（l e f t v e n t r i c u l a r e n d-s y s t o l i c
d i m e n s i o n,L V D s），舒张末期内径(l e f t v e n t r i c u l a r
end-diastodic dimension,LVDd)并计算左室长轴缩短率
（shortening,FS%）。
     7.Masson染色检测
     移植4周后，长轴中点处垂直于长轴将左心室一分为
二，按标准的病理技术行甲醛固定，石蜡包埋，4μ m厚度连
续切片，行改良Masson三色染色。梗死面积计算方法为：梗
死面积百分比＝胶原面积／总面积×100%。
     8.数据统计
     进行至少3组独立试验，每组数据均用平均数±标准差
表示。运用单因子变异数数据分析评估统计数据的差异显著

Laboratory RanevdieCwlinaincdalCInMvEesLteigcatutiroen            41  FAM 2016 Jan/Feb Vol.23 Issue 1
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